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干燥综合征(Sjogren,s syndrome,SS)是一种以泪腺,唾液腺等外分泌腺为受累器官的一种自身免疫性疾病。目前临床上尚无治疗干燥综合征的理想药物,多采取替代治疗如人工泪液、毛果芸香碱等药物缓解症状,以及免疫治疗等治疗方法,无法从根本上解决病人的痛苦,也无法有效的制止疾病的恶化。因此临床上一种低毒高效的可以治愈SS的药物有着迫切的需求。CP-25(苯磺酰芍药苷,Phenylsulfonylpaeoniflorin,代号CP-25)是芍药苷(Paeoniflorin,Pae)经酯化修饰得到的单体成分。本课题组前期研究结果表明CP-25对原发性干燥综合征小鼠模型疗效显著,但CP-25对其作用机制尚不清楚。基于以往的研究,本研究成功建立了C57BL/6小鼠抗原诱导干燥综合征动物模型,采用CP-25的有效剂量给药,观察颌下腺组织的病理结构改变,颌下腺中CXCL13、CXCR5的表达,探讨颌下腺病理改变与CXCL13-CXCR5的关系;利用人颌下腺上皮细胞株(Huamn salivary gland,HSG)与B淋巴细胞株进行共培养,采用transwell,免疫共沉淀和Western blot等技术,以IFN-α为刺激剂,观察CXCR5受体信号转导通路和GRK2相互作用,阐明CP-25对CXCR5受体信号通路的调节作用,为揭示CP-25的对SS的抗炎免疫调节作用的机制提供依据。目的:通过C57BL/6小鼠抗原诱导干燥综合征模型,研究CP-25调节B淋巴细胞在干燥综合征中的亚群比例以及功能;阐述CXCL13-CXCR5-MAPK信号通路在B淋巴细胞迁移功能中作用,明确CP-25通过调节GRK2的转膜,参与CXCL13-CXCR5-MAPK信号通路治疗SS的机制。方法:测量小鼠唾液量以及小鼠体重后,将C57BL/6小鼠随机分配到5组,即正常组,模型组,CP-25(35,70mg/kg)和HCQ(80mg/kg)组,每组8只小鼠。在平时的饲喂中,注意观察小鼠毛色等一般状况,每隔一周小鼠称重一次;在注射抗原前一天检测小鼠唾液分泌:毛果芸香碱腹腔注射,刺激唾液腺分泌,收集10min唾液量;第6周开始灌胃给药,连续给药两周,在第8周末处死小鼠后,进行小鼠脾、胸腺及颌下腺指数评估;CCK-8法检测各组小鼠胸腺脾脏T、B淋巴细胞增殖;对颌下腺组织进行H&E染色,病理学评分;流式细胞仪检测外周血以及颌下腺B细胞亚群比例变化;Western blot法检测各组小鼠颌下腺中相关蛋白的表达。在体外实验中,根据给药情况,分为五组,即正常对照组,IFN-α处理组,IFN-α+CP-25(10-5-10-7mol/ml)。Q-PCR法检测IFN-α处理后的HSG细胞CXCL13的表达;CCK-8法检测CP-25对HSG细胞与B淋巴细胞共培养后,两种细胞增殖能力的影响;Transwell法检测CP-25对共培养后B淋巴细胞迁移能力的影响;Western blot法检测颌下腺组织以及与HSG细胞共培养后B淋巴细胞CXCR5、p-ERK、p-P38、GRK2蛋白的的表达。结果:1)与正常组相比,SS小鼠体重减轻,毛色干枯,常出现舔舐口唇等现象;给药组体重较SS小鼠明显增加,毛色以及舔舐口唇等现象有所减轻;2)与正常组相比,SS小鼠唾液量明显减少。CP-25给药组给药1周后,CP-25(70mg/kg)能明显提高唾液量;给药2周后,CP-25(35,70mg/kg)组唾液量明显增加,HCQ(80mg/kg)组给药后能明显提高唾液分泌;3)与正常组相比,SS小鼠脾指数,胸腺指数以及颌下腺指数均显著升高。CP-25组给给药后可以显著降低SS小鼠脾指数,胸腺指数以及颌下腺指数;HCQ组给药可以降低SS小鼠胸腺指数以及颌下腺指数。4)与正常组相比,SS小鼠胸腺T淋巴细胞、脾脏B淋巴细胞增殖出现明显的升高。CP-25(70mg/kg)能够显著抑制T、B淋巴细胞的增殖;CP-25(35mg/kg)能够显著抑制T淋巴细胞增殖,HCQ(80mg/kg)能够明显抑制B淋巴细胞的增殖。5)与正常组相比,SS小鼠颌下腺病理H&E染色均显示出淋巴细胞的浸润;浸润严重程度,表现为淋巴细胞浸润灶数量的增加与面积的增大。CP-25(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能显著降低颌下腺组织中的淋巴细胞浸润。6)在外周血的B淋巴细胞亚群的检测中,与正常组相比,SS小鼠浆细胞、记忆B细胞以及成熟B细胞比例明显升高,未成熟B细胞比例降低。CP-25可以显著降低外周血浆细胞、记忆B细胞以及成熟B淋巴细胞的的比例,对未成熟B淋巴细胞的升高作用无统计学差异。HCQ可以降低成熟B淋巴细胞比例,对浆细胞、记忆B细胞以及未成熟B细胞比例的影响无统计学差异。在颌下腺的B淋巴细胞亚群的检测中,与正常组相比,SS小鼠浆细胞比例显著升高,CP-25可以降低浆细胞的比例,HCQ对颌下腺浆细胞比例的作用无明显统计学差异。7)对小鼠颌下腺组织切片进行CD19,CXCR5荧光双染,对组织进行荧光定量分析,发现SS小鼠双染荧光强度明显高于正常组。利用Western blot法进行颌下腺组织蛋白的检测,SS小鼠p-ERK以及p-P38表达升高。CP-25给药组能降低异常蛋白的表达;8)IFN-α处理HSG细胞48h,经过Q-PCR的检测,CXCL13表达上升,CP-25组与模型组无统计学差异。9)与B淋巴细胞共培养后,利用CCK-8法检测,HSG细胞增殖活力下降,CP-25可以抑制共培养后的HSG细胞增殖活力下降;B淋巴细胞增殖活力无明显变化;10)与HSG细胞共培养24h后,B淋巴迁移能力增强,CP-25可以减弱B淋巴细胞的迁移能力11)经过共培养后的B淋巴细胞GRK2、CXCR5、p-P38和p-ERK的表达上升,CP-25可以降低蛋白的表达结论:1.CP-25对SS小鼠有治疗作用;2.CP-25的治疗作用可能与其调节B细胞亚群比例及增殖迁移有关;3.CP-25通过调节CXCL13-CXCR5-MAPK信号通路,调节B淋巴细胞功能。