家蚕是一种重要的经济昆虫,也是一种完全变态昆虫,其一生经历卵、幼虫、蛹、蛾四个阶段,其作为一种鳞翅目模式昆虫被广泛研究,在昆虫生理、发育、遗传和免疫调节等方面的科学研究中起着重要的作用。家蚕的贮藏蛋白是属于节肢动物一类特殊且保守的血蓝蛋白,具有明显的时期表达特异性和性别表达差异性,是昆虫分子生物学研究的经典案例之一。但是家蚕贮藏蛋白的生物学功能迄今为止尚未完全解析。本文利用CRISPR-Cas9基因编辑系统成功突变了家蚕芳基贮藏蛋白2（Bm SP2）基因,经过筛选鉴定成功建立了SP2纯合突变家蚕品系。研究发现,Bm SP2缺失后,家蚕的生长繁殖、变态发育及免疫抗性均受到影响,并深入研究了Bm SP2在家蚕生命历程中的功能。主要研究结果如下:1、Bm SP2的基因信息和表达特征分析利用家蚕基因组最新数据库查询到Bm SP2基因全长2112 bp,包含5个外显子,编码一个由703个氨基酸组成的蛋白质,其中包含约20%的芳香族氨基酸。利用RT-q PCR对Bm SP2的表达模式进行分析,结果显示,Bm SP2在家蚕幼虫第三龄时期前处于一个极低的表达水平,进入第四龄期后表达量急剧升高。组织表达分析结果显示,Bm SP2主要在家蚕的头部、表皮、脂肪体中高量表达,且在脂肪体中表达量最高。2、Bm SP2的敲除和SP2纯合突变家蚕品系的建立利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除家蚕Bm SP2基因。根据敲除靶点设计原则,在Bm SP2基因的外显子区域设计了三个敲除位点,合成对应的敲除引物,构建了对应的重组转基因g RNA载体。并在家蚕Bm E细胞系中验证了三种g RNA载体在敲除系统中的敲除效果,最终选择以第三外显子区域设计的g RNA载体注射到刚产下的家蚕蚕卵。在G1代蚕卵成功筛选到SP2-g RNA阳性个体家蚕,将其与本实验室保存的Cas9阳性家蚕杂交,获得G2代。经过一系列的饲养、筛选、基因组测序,最终获得SP2纯合突变家蚕品系,且该品系家蚕的基因组没有g RNA片段和Cas9序列的插入。对该品系家蚕的Bm SP2基因的表达进行分子检测,其转录水平和翻译水平检测结果都表明Bm SP2被完全敲除。3、缺失Bm SP2后对家蚕生长发育和卵孵化率的影响连续饲养SP2纯合突变品系家蚕,对其表型和经济性状进行观察统计发现,缺失Bm SP2后,家蚕的的蛹重、茧层重均发生明显的降低,且相对于野生对照组家蚕,SP2纯合突变雄性家蚕比雌性家蚕降低得更为明显。对SP2纯合突变家蚕的另外两种贮藏蛋白Bm SP1和Bm SP3的转录水平和翻译水平进行检测,结果显示,Bm SP2缺失后,家蚕的Bm SP1和Bm SP3的表达均发生显著上调。暗示了Bm SP1和Bm SP3的上调表达对Bm SP2的缺失具有补偿作用。敲除Bm SP2后,家蚕的卵发育受阻,造成蚕卵孵化率降低。而家蚕卵孵化率与家蚕的卵黄原蛋白Vg有着重要的关系,本研究对SP2纯合突变品系家蚕的卵黄原蛋白表达检测发现,相对于野生对照组家蚕,其Vg的转录水平和蛋白水平均发生了显著性的下调。此外,有文献报道家蚕血淋巴中的酪氨酸含量能够调控Vg的表达,本研究发现SP2敲除后,家蚕血淋巴中的酪氨酸含量发生显著性降低,推测酪氨酸是作为Bm SP2调控Vg合成的中间媒介。4、缺失Bm SP2后对家蚕免疫抗性的影响在SP2纯合突变品系家蚕的饲养过程中,我们发现家蚕容易在第四龄后期和第五龄早期感染细菌病,而野生对照组家蚕却保持健康状态。我们提取家蚕的脂肪体总蛋白进行了LC-MS/MS定量蛋白质组学分析,总共鉴定到228种差异蛋白质,其中90种蛋白发生上调,138种蛋白下调。对鉴定到的差异蛋白质进行GO分析,结果显示,部分差异蛋白被富集到免疫系统进程和免疫反应,所以我们推测Bm SP2的缺失可能会降低家蚕的免疫抗性。将家蚕饲养至五龄第2天,分别用不同的病原微生物侵染家蚕,统计其存活曲线和计算半数致死时间(LT50),结果表明,不管是侵染细菌、真菌还是家蚕病毒,SP2纯合突变品系家蚕的存活时间显著低于野生对照组家蚕,接着我们检测了注射白色念珠菌6 h后家蚕脂肪体两种抗菌肽的转录水平,结果显示,相对于野生对照组家蚕,SP2纯合突变品系家蚕脂肪体抗菌肽表达水平显著低于对照组。该结果暗示Bm SP2的缺失导致家蚕在受到病原威胁时所产生的抗菌肽表达量不足,从而导致家蚕免疫抗性降低,更容易被病原微生物侵染。