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背景:刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,Tg）是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫,且全球广泛传播,可以感染几乎所有温血动物,严重危害人类健康和畜牧业生产。弓形虫感染宿主引起的弓形虫病有不同的临床表现,主要由弓形虫株毒力及宿主差异所决定。弓形虫可以通过胎盘感染胎儿。在产前筛查中（TORCH检测）,弓形虫（T）的先天性垂直传播是导致不良妊娠的重要因素之一。近些年,有研究发现弓形虫感染会导致小鼠不良妊娠结局,其机制包括胎盘调节性T细胞（Treg）数量减少和功能障碍和Th17细胞上调等。弓形虫株毒力与不同基因型携带的效应分子多态性（Effectors polymorphisms）密切相关。已知来源于北美及欧洲人兽弓形虫虫株主要有三个基因型,即Type I、II和III型;而我国则以Chinese 1（Toxo DB#9）型为优势基因型。弓形虫侵入细胞释放的多态性效应分子蛋白主要包括棒状体分泌的ROPs家族如ROP16、ROP18等;以及致密颗粒分泌的GRA家族如GRA15、GRA5和GRA3等。宿主抗弓形虫感染过程中,弓形虫可以逃避免疫相关杀伤机制,因此巨噬细胞（Mφ）和单核吞噬细胞成为感染早期杀伤和抑制弓形虫的主要效应细胞,在宿主固有免疫应答中发挥关键作用。研究发现,弓形虫I和III型虫株的ROP16蛋白可以磷酸化STAT3、STAT6从而使Mφ激活为旁路激活表型（AAMs,也称为M2）,导致IL-4、IL-13的大量产生;弓形虫II型虫株的GRA15蛋白可以直接磷酸化NF-κB p65蛋白,使Mφ激活为经典激活表型（CAMs,也称为M1）,导致大量促炎性因子如IL-1β、IL-23和IL-6的释放,诱导Th17和NK细胞的活化。本研究通过对弓形虫的Ⅰ/Ⅲ型虫株携带的多态性ROP16Ⅰ/Ⅲ和II型虫株携带的GRA15Ⅱ基因与巨噬细胞相互作用免疫机制研究,揭示二种虫源性效应分子激活巨噬细胞的途径,及其对小鼠不良妊娠结局的影响。目的:研究弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ和GRA15Ⅱ基因转染小鼠巨噬细胞是否能够构建稳转细胞系,及转染以后基因对巨噬细胞表型及结构的影响。针对稳转细胞对小鼠妊娠结局的影响,探讨ROP16Ⅰ/Ⅲ和GRA15Ⅱ基因与不良妊娠的关系,并探讨不良妊娠发生过程中免疫机制的改变。方法:扩增弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ和GRA15Ⅱ基因片段,构建慢病毒载体,分别与空病毒载体感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,获得re GRA15Ⅱ-RAW264.7、re ROP16Ⅰ/ⅢRAW264.7及空病毒稳转细胞株。通过流式检测细胞表面标志PD-L1、PD-L2,ELISA方法检测细胞培养上清细胞因子（TGF-β、IL-10、IL-6、IL-23、IL-12、IL-1β、IL-17A）和NO及尿素的含量,荧光定量PCR法（q PCR）检测i NOS和Arg-1的转录,蛋白免疫印迹法检测STAT3、STAT6和NF-κB的表达,判断巨噬细胞的偏移/极化方向（M1或M2）。将三种稳转细胞系送检全基因表达谱芯片分析。分别将稳转细胞株与小鼠脾细胞磁珠分选的CD4+CD62L+T细胞共培养,通过流式、ELISA及q PCR法检测Th17活化指标。构建C57BL/6孕鼠模型,在孕早期7.5天分别输注1x106个re GRA15ⅡRAW264.7细胞、空病毒-RAW264.7感染细胞或感染PRU虫株200个速殖子,孕中期14.5天处死小鼠,检测胎鼠、胎盘一般情况及组织病理检查,计算吸收率和子宫活胎数;流式分别检测脾脏及胎盘的TH1/TH2/TH17细胞因子表达情况。结果:成功构建re GRA15Ⅱ-RAW264.7、re ROP16Ⅰ/Ⅲ-RAW264.7及空病毒-RAW264.7稳转细胞株,流式结果显示三种细胞系表面分子CD80、CD86均明显高表达;re GRA15Ⅱ--RAW264.7细胞表面标记PD-L1表达明显上调,培养上清液中炎性因子IL-6、IL-23、IL-1β、IFN-γ、IL-17和NO明显升高,NF-κB入核导致核内NF-κB p65增多,诱导性一氧化氮合酶（i NOS）表达上调;re ROP16Ⅰ/Ⅲ--RAW264.7表面标记PD-L2增多,上清液中IL-13、IFN-γ和尿素（Urea）水平升高,Arg-1（精氨酸酶-1）明显上调。re GRA15Ⅱ--RAW264.7细胞与CD4+CD62L+脾T淋巴细胞共培养,流式检测淋巴细胞表面标记和上清中IL-17A升高。与对照组相比,C57BL/6孕鼠输注re GRA15Ⅱ-RAW264.7细胞组胎鼠吸收率升高,出现大量死胎、胎盘出血、机化现象,子宫活胎数降低;与正常及对照孕鼠相比,脾细胞表面IL-17表达升高,CD4+CD25+Fox P3（Tregs）表达降低。结论:本次研究成功构建小鼠巨噬细胞来源的re GRA15Ⅱ-RAW264.7、re ROP16Ⅰ/ⅢRAW264.7及空病毒-RAW264.7三种稳转细胞株,验证GRA15Ⅱ是介导小鼠Mφ向M1偏移/极化的重要虫源性效应因子;ROP16Ⅰ/Ⅲ是介导小鼠Mφ向M2偏移/极化的重要因素,但和弓形虫感染的巨噬细胞表型相比又存在差别。GRA15Ⅱ介导的极化巨噬细胞可以活化初始T细胞转化成Th17,输注该细胞可显著导致小鼠不良妊娠结局的发生,提示弓形虫致畸可能与基因型相关的毒力因子（genotypeassociated virulence factor）GRA15Ⅱ相关。