研究目的和意义子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是指具有生长功能的子宫内膜出现在宫腔以外的部位,引发以盆腔疼痛和不孕为特点的持续性病变,在育龄妇女中的发病率约为10-15%,且有逐年上升的趋势。患者中不孕症的发生率达40-50%,是非EMs人群的20倍,是导致不孕的重要原因之一。2000年Buyalos等首次提出" Endometriosis-associated infertility ",即“内异症相关性不孕症”的概念。EMs可通过多种机制协同影响,引起不孕,包括：盆腔解剖结构异常,如盆腔粘连、输卵管梗阻可影响排卵、精卵运送及结合；腹腔液成分的改变,如过高的前列腺素(prostaglandin, PG)和／或巨噬细胞可影响卵泡的发生、发育和成熟,影响卵母细胞的受精以及早期胚胎的质量；未破裂卵泡黄素化综合征(Luteinized unruptured follicle syndrome, LUFS);黄体功能不全(Luteal Phase defect, LPD);以及EMs在位子宫内膜异常对囊胚着床的影响。虽然有许多因素导致EMs生殖功能下降,但到目前为止,EMs引起不孕的原因与EMs发病机制的关系尚不能完全明确,单纯药物或手术治疗对其生育状况的改善效果并不理想,故需进一步研究EMs不孕的病因,对EMs相关性不孕的机理进行研究,为其诊治寻找新的靶点。近年来,随着现代辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)的广泛开展,对EMs不孕患者行体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)时胚胎移植率可高达85%,但妊娠率仅20%左右,仅为输卵管因素者的一半,表明EMs患者的在位子宫内膜存在影响胚胎着床的诸多不利因素。子宫内膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指子宫内膜在特定时期内对胚胎植入的接受能力,这一时期被称为“种植窗期”(window of implantation, WOI),其形成于月经周期第20-24天,即促黄体生成素(luteotropic hormone, LH)高峰后的6-10天。胚胎只有在这一时期才能植入,在“种植窗”开放前或后,胚胎都不能植入。子宫内膜容受性的形成除受雌、孕激素的协调作用,同时还有多种分子参与调节,包括细胞因子、黏附分子、前列腺素类、糖复合物等。在此窗口期内,上述因子协调作用,可以引起子宫内膜发生一系列形态学及生理功能的改变,从而营造利于胚胎着床的微环境。但是,“种植窗”的开放和关闭有着非常复杂的调控机制,至今为止,还没能找到一种标志物明确地用于临床实践来评价子宫内膜容受性。近年来的研究显示,EMs患者在位子宫内膜特异性基因及蛋白的异常调节与其子宫内膜容受性降低有关,包括与细胞粘附、胚胎毒性、免疫功能失调、凋亡反应以及与EMs发病有关的基因和蛋白,如整合素、芳香化酶、基质金属蛋白酶、血管生成因子等表达的变化。因此,EMs患者在位子宫内膜容受性的改变可能是其不孕的重要原因之一。虽然有许多因素可降低EMs不孕患者的子宫内膜容受性,但到目前为止,EMs不孕患者“种植窗”时期,子宫内膜容受性建立机制和调控因素是否改变、如何改变尚不清楚,在位内膜容受性改变的形态学和分子标记还有待探寻。然而,研究子宫内膜容受性的传统方法均存在着局限性：超声检查缺乏统一标准,且因超声医生的水平高低而结果差异很大；组织学检查存在标本之间、周期之间的差异,且不可在移植周期取材；基因芯片研究并不能完全反映功能蛋白质的变化。因此,“种植窗”时期内膜的评估需要有一种更客观、更全面的检测方法,而蛋白质组学研究的开展为此提供了可能性。随着人类基因组学研究的逐渐完成,生命科学的探索已经进入了后基因组时代,即蛋白质组时代。蛋白质组是指：一个基因组,一种生物或一个细胞所表达的全部蛋白质,即细胞或组织在特定空间和时间上表达的全部蛋白质；蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,大规模研究蛋白质的特征及结构,包括蛋白质的组成成分、表达水平、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互作用等,在蛋白质水平上了解细胞的各种功能、生理变化及疾病的病理过程。蛋白质组学集中于动态描述基因调节,对基因表达的蛋白质水平进行相对定量测定,以及解释基因表达调控的机制。与传统的研究手段比较,蛋白质组学具有高通量、高效率、高准确性等特点,目前已经被广泛应用于多方面的研究。EMs子宫内膜对胚胎接受性的功能改变是一个由多基因参与、连续动态变化的复杂过程,不同功能的蛋白质在时间与空间上有序协同作用的结果。蛋白质组学技术具有观察多基因事件引起的蛋白质组分整体变化、进行时间与空间连续研究的独特优势,为研究EMs“种植窗”时期子宫内膜蛋白质表达的变化提供了优良的技术平台。因此我们课题以正常育龄期妇女、EMs合并不孕患者为研究对象,使用蛋白质组学的研究方法一荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differential in-gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assist laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)对二者“种植窗”在位子宫内膜的蛋白质表达变化进行研究。建立人类“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE和MALDI-TOF-MS研究体系,完成正常育龄期妇女以及EMs患者“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE图谱,鉴定差异表达的蛋白质,并通过Western blot对目标蛋白进行半定量分析,力求从蛋白总体水平探究EMs患者的在位子宫内膜容受性异常的机制,为临床治疗提供客观、科学的研究依据,有助于提高EMs患者ART助孕成功率。第一章正常育龄期妇女种植窗时期子宫内膜的差异蛋白质组学研究研究目的建立人类“种植窗”时期子宫内膜蛋白的2D-DIGE和MALDI-TOF-MS研究体系,获得正常育龄期妇女“种植窗”时期子宫内膜蛋白质2D-DIGE图谱,并利用质谱技术鉴定差异蛋白,以探寻子宫内膜容受性调控的分子机制。研究方法选取10名正常育龄期妇女志愿进入本研究,采用经阴道超声监测卵泡发育,结合血、尿促黄体生成素(luteotropic hormone, LH)测定,确定LH峰日以及排卵日(ovulatory day, OD)。通过组织微创活检分别获取“种植窗”前(OD+1天)和“种植窗”时期(OD+6天)的子宫内膜组织样本20份,每份样本分为两部分：一部分制备组织切片,行HE染色内膜形态学检查；另一部分经纯化、提取总蛋白样品。蛋白样品Cydye染料标记后进行2D-DIGE,经不同波长的激光扫描后,获得2D-DIGE表达图谱,使用DeCyder软件分析,选取差异表达的蛋白质斑点。通过全自动斑点处理工作站切点、酶解和点样后,利用MALDI-TOF-MS进行蛋白质鉴定,并到本地NCBInr、在线MASCOT蛋白质数据库验证。研究结果1.子宫内膜组织时相OD+1天10例均为分泌早期,OD+6天10例均为分泌中期。2.获得“种植窗”子宫内膜蛋白2D-DIGE图谱,经质谱和数据库分析鉴定差异蛋白38个,其中30个上调表达,8个下调表达。小结1.建立人类“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质的2D-DIGE和MALDI-TOF-MS研究体系。2.获得正常育龄期妇女“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE图谱。3.鉴定正常育龄期妇女“种植窗”时期子宫内膜差异表达的蛋白质38个,其中30个上调表达,8个下调表达。第二章子宫内膜异位症患者种植窗时期子宫内膜的差异蛋白质组学研究研究目的获取EMs患者“种植窗”时期子宫内膜蛋白质2D-DIGE图谱,通过质谱技术鉴定差异蛋白,并利用DeCyder软件分析找到EMs组和正常组“种植窗”的差异蛋白点,以探寻EMs不孕患者子宫内膜容受性改变的机制。研究方法选取10名EMs不孕患者志愿进入本研究,采用经阴道超声监测卵泡发育,结合血、尿LH激素测定确定LH峰日以及排卵日。通过组织微创活检分别获取“种植窗”前(OD+1天)和“种植窗”时期(OD+6天)的子宫内膜组织样本20份,每份样本分为两部分：一部分制备组织切片,行HE染色内膜形态学检查；另一部分经纯化、提取总蛋白样品。蛋白样品Cydye染料标记后进行2D-DIGE,经不同波长的激光扫描后,获得2D-DIGE表达图谱,使用DeCyder软件分析,选取差异表达的蛋白质斑点。通过全自动斑点处理工作站切点、酶解和点样后,利用MALDI-TOF-MS进行蛋白质鉴定,并到本地NCBI、在线MASCOT蛋白质数据库验证。最后,利用DeCyder软件分析找到EMs组和正常组“种植窗”的差异蛋白点。研究结果1.子宫内膜组织时相OD+1天10例均为分泌早期,OD+6天10例均为分泌中期。2.获得“种植窗”子宫内膜蛋白2D-DIGE图谱,经质谱和数据库分析鉴定差异蛋白42个,其中38个上调表达,4个下调表达。3.鉴定EMs组和正常组“种植窗”的差异蛋白7个,其中4个上调表达,3个下调表达。小结1.完成EMs不孕患者“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE图谱。2.鉴定EMs不孕患者“种植窗”时期子宫内膜差异表达的蛋白质42个,其中38个上调表达,4个下调表达。3.鉴定EMs组和正常组“种植窗”的差异蛋白7个,其中4个上调表达,3个下调表达。第三章差异蛋白的Western blot验证研究目的应用western blot对膜联蛋白A4 (Annexin A4,ANX A4)和硒结合蛋白1(Selenium-binding protein 1, SBP1)进行“种植窗”时期在位子宫内膜组织表达的半定量验证。研究方法利用此前获取的EMs不孕患者和正常育龄期妇女的OD+6天的子宫内膜的蛋白样品进行western blot验证。选择差异蛋白ANX A4.SBP1应用western blot行半定量分析。研究结果1.Western blot显示EMs组OD+6天子宫内膜的ANX A4表达较正常组显著下降(t=7.654,P=0.002)。2. Western blot显示EMs组OD+6天子宫内膜的SBP1表达较正常组显著增强(t=-2.709,P=0.035)。小结1.首次证实在EMs“种植窗”时期子宫内膜组织中,ANXA4表达显著下降。2.首次证实在EMs“种植窗”时期子宫内膜组织中,SBP1表达显著增强。全文小结1.建立了人类“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D.DIGE和MALDI-TOF-MS研究体系,为进一步研究“种植窗”时期子宫内膜蛋白质表达的变化提供了优良的技术平台。2.完成正常育龄期妇女“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE图谱,鉴定了差异表达的蛋白质38个。3.完成EMs不孕患者“种植窗”时期子宫内膜组织蛋白质2D-DIGE图谱,鉴定差异表达的蛋白质42个。4.利用软件鉴定EMs组和正常组“种植窗”的差异蛋白7个,其中4个上调表达,3个下调表达5.利用Western blot证实在EMs“种植窗”时期,ANX A4表达显著下降,而SBP1表达显著增高。