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鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种具有高毒力的革兰氏阳性菌,能感染多种淡水和海水鱼类,每年给世界水产养殖业带来数以亿计的损失,近几年在我国南方罗非鱼养殖区肆虐流行,严重阻碍了我国罗非鱼养殖业的发展。鉴于单克隆抗体具有高度的特异性和灵敏性等优点,在病原检测方面有着突出的优势,本研究制备了抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体,并利用所生产的的单抗建立的夹心ELISA方法,如下:1.以罗非鱼源无乳链球菌GD09株灭活全菌抗原作为免疫原免疫6—8周龄的BALB/c小鼠,免疫3-4次并在效价达到1:12800以上时进行细胞融合,用建立的间接ELISA法进行筛选,制备了 9株抗罗非鱼源无乳链球菌全菌抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4C12、4B5、3A9、3A10、3A12、3C5、1F1、4D12、3D2。经鉴定9株杂交瘤细胞染色体计数为90～110条,均大于亲本细胞,亚类鉴定结果显示4C12、3A10属于IgG2a亚类,4B5、4D12 属于 IgG1 亚类,3A9、3C5、1F1、3A12、3D2 属于 IgM 亚类;经测定 9 株单抗 4C12、4B5、3A9、3A10、3A12、3C5、1F1、4D12、3D2 上清效价分别为 1:214、1:210、1:212、1:28、1:212、1:212、1:211、1:210、1:210,测定 3 株腹水效价分别为 4C12(1:224)、3A10(1:224)、3A9(1:216);对不同传代细胞株和冻存1个月后复苏细胞株的测定表明,9株杂交瘤细胞株均能稳定地分泌单克隆抗体。2.对3A9和4C12单抗的腹水分别进行纯化,将3A9作为捕获抗体包被到ELISA板,采用过碘酸钠氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到纯化的4C12单抗上作为酶标抗体,建立了检测无乳链球菌的双抗体夹心ELISA方法,结果显示,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:单克隆抗体3A9包被浓度为10.24μg/mL,HRP酶标4C12抗体工作浓度为1:1000,判定标准以OD450nm≥0.210作为阴阳临界值。用该ELISA方法分别检测鳗弧菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、豚鼠单胞菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌全菌悬液。结果表明,该ELISA方法与以上病原均无交叉反应,说明用我们制备的单抗建立起来的ELISA方法具有良好的特异性。敏感性实验结果表明,该双抗夹心ELISA检测无乳链球菌的检出限3.2X 104CFU/mL。同时检测30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼的不同组织,结果显示均能检测到,且在肝脾检出率较高。本研究成功制备了 9株稳定分泌抗无乳链球菌全菌抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞系,利用杂交瘤细胞制备的单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,并对无乳链球菌感染的罗非鱼的不同组织取样进行了检测,获得了良好的检测效果,这些研究成果为进一步开发和建立罗非鱼无乳链球菌病的免疫诊断方法奠定了良好的基础,为罗非鱼乳链球菌病的防治提供了强有力的技术支撑。