论文部分内容阅读
癌症的发展是包含癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭和肿瘤血管形成等多步骤的复杂过程。近几十年的研究显示，细胞内活性氧（ROS）的调控紊乱与细胞的癌变密切相关。细胞能够通过一系列信号转导途径和酶促反应系统产生和清除ROS，以维持其在细胞内的平衡。然而，在氧化应激状态下，过多的ROS能够对胞内DNA、蛋白质和脂质造成损伤，引发包括癌症在内的多种疾病。由于每种单一ROS对癌细胞的作用有所不同，因此ROS与癌症的关系极为复杂。H2O2作为单一ROS，与其它ROS相比较为稳定，是一种调控癌细胞信号转导的重要分子。H2O2对癌细胞增殖的调节及其作用机制并不清楚。在乳腺癌细胞中，H2O2通过阻断细胞周期进程并诱导细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖。在肺癌细胞中，H2O2所介导的细胞周期停滞与两种细胞周期相关基因cyclin D1和cyclin E的表达下调相关联。在结肠癌细胞中，H2O2诱导的细胞凋亡与促凋亡基因BAX的表达上调相关。因此，为了探究H2O2调节癌细胞增殖的机制，本实验检测了细胞周期相关基因cyclin D1、cyclin E和凋亡相关基因BAX在乳腺癌细胞中的表达。肿瘤抑制基因Deleted in liver cancer1（DLC1）在多种癌细胞中缺失或低水平表达。实验证实，通过转染使DLC1在癌细胞中过表达后，癌细胞的增殖和迁移受到显著抑制。DLC1与大鼠p122RhoGAP序列有80%的同源性，因此它成为了RhoGTPase-ActivatingProtein（RhoGAP）家族的一个新成员，并且能够发挥其RhoGAP活性抑制癌细胞的迁移。RhoA是RhoGTPase家族特征化最好的一个成员，受到DLC1的负向调控。DLC1能够使活化状态的RhoA-GTP水解为失活状态的RhoA-GDP，进而阻断下游信号通路，抑制细胞骨架形成和细胞迁移。虽然ROS和DLC1对癌细胞的增殖和迁移都具有调节作用，但是两者的关系仍不清楚。而且单一ROS对GAP的调节作用也未见报导。因此，本实验进一步探究了H2O2对DLC1的调节作用，以及DLC1/RhoA信号途径调控癌细胞骨架结构和迁移的分子机理。实验结果显示：1、H2O2对乳腺癌细胞MCF7的增殖具有低促高抑的调节作用，这主要取决于H2O2的浓度。5-15μΜ H2O2能够促进癌细胞的增殖，而30-200μΜ H2O2以一种浓度依赖性的方式抑制癌细胞增殖，且半数抑制浓度（IC50）为94μΜ。2、100μΜ H2O2下调了MCF7细胞中cyclin D1和cyclin E的表达，通过阻断细胞周期进程抑制癌细胞增殖。3、H2O2通过上调促凋亡基因BAX的表达，诱导MCF7细胞凋亡，这也成为了H2O2抑制癌细胞增殖的一个重要方面。4、与正常细胞相比，H2O2提高了H1299细胞中DLC1的表达水平，下调了RhoA-GTP的表达，使RhoA的活化程度显著降低。5、通过抑制RhoA的活性，50μM H2O2减少了乳腺癌MDA-MB-231细胞内应力纤维的形成，100μM H2O2加剧了应力纤维数量的减少。而且MDA-MB-231细胞的迁移能力也受到50-200μΜ H2O2的抑制，并且抑制作用随着浓度增加越来越显著。这些结果表明，H2O2对癌细胞增殖的抑制作用是通过下调细胞周期和凋亡相关基因，进而造成细胞周期停滞并诱导细胞凋亡来发挥的。H2O2还能够通过上调癌细胞中DLC1的表达，抑制RhoA活性，从而负向调控RhoA介导的信号通路，减少胞内应力纤维的形成，最终抑制癌细胞的迁移。本实验首次证明了H2O2能够上调RhoGAP家族成员DLC1的表达，进而降低RhoA的活性。提示单一一种活性氧H2O2调节的DLC1/RhoA信号途径可以为抑制肿瘤迁移提供实验依据。