1.目的骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤。通常在青少年和年轻成年人的长骨干骺端。每一百万人中有四到五人患病。预后差。治疗方法主要是采取手术治疗并结合放化疗。自从应用联合化疗的方案实施后，过去十年里大约有60%-70%的骨肉瘤患者的五年生存率已经大大提高。但有相当一部分患者对放化疗不敏感或在放化疗后出现耐药现象。虽然这些年对骨肉瘤的分子机制的了解已经有所增加，但对骨肉瘤的分子及机制还没有更深入更全面的了解。如肿瘤的形成、肿瘤的发展和转移、耐药的发生等。近年来对于骨肉瘤多药耐药的研究已经成为了热点。我们着眼于基因及蛋白水平，以人成骨肉瘤长春新碱耐药细胞的基因及蛋白为靶点，为骨肉瘤多药耐药的进一步治疗提供了模型及理论依据。为人成骨肉瘤多药耐药的逆转开辟了思路。瘦素（Leptin），16kda的非糖基化的荷尔蒙激素，是肥胖基因蛋白的的产物，定位于人的第7号染色体。主要有脂肪组织合成和分泌，由下丘脑介导发挥调节能量平衡，内分泌，免疫及代谢功能。近些年来的一些研究已经表明，血清瘦素与绝经后妇女的骨质疏松有密切关系，并且瘦素与肝癌治疗后的复发有关。一些体外的研究表明，骨髓基质细胞对瘦素具有敏感性。这增加了他们的增殖，成骨细胞谱系的分化和矿化结节的数量，但抑制了他们分化为脂细胞。近些年研究发现瘦素在很多的恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用，如乳腺癌，大肠癌，肺癌等。但关于瘦素和人成骨肉瘤以及其耐药细胞的生长作用和机制研究国内外仍未见阐明。我们的最新研究结果显示是， LIMK1在耐药的骨肉瘤细胞中的表达明显高于人成骨肉瘤细胞。当使用siRNA干扰抑制了LIMK1基因时，明显缓解了细胞的耐药性，并抑制了细胞的迁移。由此可见，过表达的LIMK1对肿瘤细胞的耐药性及侵袭性起着重要的调控作用。它可能是引起肿瘤细胞耐药及转移关键的分子之一。本研究以LIMK1为靶点，为进一步研究LIMK1在瘦素介导的肿瘤耐药细胞增殖及迁移的机制和肿瘤耐药治疗学研究提供了新的理论基础和实验依据。2.方法本实验以体外培养的人成骨肉瘤长春新碱耐药细胞MG63/VCR细胞为对象，在已建立的人成骨肉瘤长春新碱耐药细胞模型的基础上，采用小剂量的持续诱导的方法维持其耐药性。通过RT-PCR技术检测瘦素诱导前后MG63/VCR细胞的耐药基因MDR1的表达变化以及LIMK1基因的表达变化。并通过基因转染技术研究沉默LIMK1基因，最后我们应用RT-PCR、Westernblot等技术检测转染效率。采用CCK8法、流式细胞技术、划痕试验法分别观察转染LIMK1后经瘦素诱导的MG63/VCR细胞的增殖情况、周期变化以及迁移情况。进而探讨LIMK1在瘦素诱导的MG63/VCR细胞中作用。3.结果经过200ng/ml瘦素诱导MG63/VCR细胞后，通过RT-PCR技术检测MDR1基因LIMK1基因表达，结果显示，经过瘦素诱导后，细胞中MDR1基因LIMK1基因表达均增强。应用SiRNA技术沉默LIMK1基因后RT-PCR技术、Westernblot技术验证转染效率结果显示转染效率可达70%。通过CCK8法检测转染后瘦素诱导的MG63/VCR细胞的增殖情况。我们发现，当沉默了LIMK1后，细胞的增殖较未沉默加瘦素组明显缓慢。流式细胞法检测沉默LIMK1后细胞的周期的变化，我们发现与CCK8法得到的结果相似。当沉默LIMK1后细胞的周期处于G2期S期较未沉默组加瘦素的细胞明显减少。划痕试验结果显示，瘦素诱导的MG63/VCR细胞24小时迁移距离最大。当沉默LIMK1后，细胞24小时的迁移速度较瘦素诱导组明显减慢。沉默LIMK1经瘦素诱导后24小时的迁移速度仍慢于未沉默瘦素诱导组。4.结论⑴证实了瘦素促进了人成骨肉瘤长春新碱耐药细胞增殖和迁移的作用。⑵发现瘦素促进LIMK1的表达；⑶进一步证实了LIMK1逆转了瘦素对耐药细胞的增殖和迁移。