研究背景遗传代谢病是由于基因突变而导致正常的物质代谢途径受阻,底物堆积、产物缺乏、旁路代谢产物增加,从而出现相应的病理改变和临床表现的一组疾病。绝大部分是常染色体隐性遗传病,少数为常染色体显性遗传、X连锁伴性遗传等。绝大多数遗传代谢病的临床表现不特异,可导致多器官系统的功能障碍,可致残,严重者可致死。遗传代谢病如未提前发现,绝大部分无有效治疗办法,因此该类疾病的发生不仅影响患儿生存质量,也造成较大的家庭与社会负担。Schimke 免疫-骨发育不良（Schimke immuno-osseous dysplasia,SIOD）,是一种罕见的常染色体隐性遗传病,主要表现为激素耐药性肾病综合征、脊柱骨骺发育不良、T细胞免疫缺陷、特殊面容。2002年国外学者确定了SMARCAL1（MIM:20606622,SWI/SNF-related,matrix-associated,actin-dependent regulator of chromatin,subfamily a.like 1）为该病的致病基因。SMARCAL1位于2q34-q36,含有18个外显子,编码954个氨基酸。截止到2014年2月,人类基因组突变数据库中共报道了SMARCAL1的相关突变100种。目前国际上对SIOD的发病机制主要有以下两种推测:（1）可能是由于细胞在增殖过程中复制叉的不稳定所引起的。研究发现,在内源SMARCALl沉寂的细胞中,与SIOD相关的突变不能阻止与复制相关的DNA损伤;但是重新导入野生型SMARCALl后,DNA的损伤情况被修复。（2）可能由于细胞周期的停滞、细胞的过早凋亡引起。Ciccia等[7]研究发现SMARCALl功能衰竭的细胞对诱导复制叉断裂的DNA损伤试剂十分敏感。综合上述这些研究成果,SMARCALl突变使与复制相关的DNA损伤加剧,并且与细胞周期的调控故障密切相关,最终导致了多系统损伤的发生。SIOD临床表现多样,但以脊柱骨骺发育不良、肾损伤最为突出,大部分SIOD患者先后以原发性肾病综合征、矮身材、重症感染等辗转就诊于不同医院及不同科室,给诊断造成极大困惑,且该病致残致死率高,目前所有已知的关于SIOD的报道都显示患者最终都会发展为肾功能衰竭,在早期表现为蛋白尿的进展,进展性的肾病对激素治疗无效,最终发展为不可逆的肾功能衰竭,这也是导致SIOD患儿死亡的一个重要原因。先前关于SIOD的诊断大多数是基于患者的临床表现,随着高通量测序技术的发展,为临床疾病诊断的精细化提供了有效保障,如果在早期蛋白尿产生阶段我们利用精准的基因诊断确诊,通过临床积极干预,减少蛋白尿的产生,从而延缓肾衰竭的过程,对于患儿的生存率及患儿家庭的生活质量来说是非常有意义的。本课题首次通过病人发现SIOD疾病的移码突变c.1071delT;p.（Phe357fs）,采用多个公共数据库进行查找,未见报道该突变,为新突变,同时应用PolyPhen2、SIFT、Align GVGD、MutationTaster等生物信息学分析软件对检测结果进行数据分析和预测,均提示该突变有害,故预测为致病突变。本课题组前期研究首次证实新突变导致Smarcal蛋白表达减少,明确其致病性。本课题将进一步应用siRNA技术沉默SMARCAL1基因,转染HEK293胚肾细胞,采用实时荧光定量PCR、Western Blot技术分别检测siRNA转染后HEK293胚肾细胞SMARCAL1mRNA及蛋白水平的表达变化,并观察细胞的增殖及凋亡情况;最后通过转录组测序的方法对SMARCAL1基因沉默细胞模型进行差异基因的筛选,并通过生物信息学的方法进行相关分析;从而进一步探讨SMARCAL1突变导致肾损伤可能的发病机制。本实验旨在丰富人类突变基因数据库中SIOD疾病的基因谱,探讨SMARCAL1基因突变在SIOD疾病中肾损伤作用及机制研究,以期为临床治疗提供新靶点和新思路。本课题将从以下两方面进行研究。第一部分:Schimke免疫骨发育不良患儿病例特点及新突变基因检测分析目的:收集临床一例矮身材患儿资料,明确该患儿基因突变具体位点、是否新及致病性的初步预测,进一步丰富人类突变基因数据库中SIOD疾病的基因谱。方法:对门诊矮身材患儿进行详细的病史采集,全面体格检查,完善三大常规、肝肾功能、电解质、血脂分析、细胞免疫及体液免疫、胰岛素样生长因子、甲状腺功能、胸腰椎正侧位片及骨盆正位片等相关辅助检查,采用全外显子测序,获取SMARCAL1基因新突变位点及功能评价。结果:1.辅助检查:细胞免疫功能异常（辅助性T淋巴细胞计数:320.25个/ul,辅助性T淋巴细胞百分比:12.21、CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞:0.33）;大量蛋白尿（24小时尿蛋白:978.11mg、尿常规:尿蛋白+++）;胸腰椎正侧位片及骨盆正位片均提示骨骼系统发育不良;存在骨骼系统、免疫系统、泌尿系统功能异常。2.全外显子测序显示:SMARCAL1基因检测到移码突变c.1071delT;p.（Phe357fs）,通过公共数据库进行查找,未见报道该突变,为新突变,同时应用PolyPhen2、SIFT、Align GVGD、MutationTaster等生物信息学分析软件对检测结果进行数据分析和预测,均提示该突变有害,故预测为致病突变。结论:1.临床发现一例SMARCAL1新移码突变SIOD患儿,突变类型为c.1071delT;p.（Phe357fs）,初步预测为新致病突变。2.新移码突变SIOD患儿存在骨骼发育不良、细胞免疫功能异常、大量蛋白尿。第二部分:SMARCAL1基因沉默对HEK293胚肾细胞功能的影响及机制研究目的:探讨SMARCAL1基因沉默对HEK293胚肾细胞功能的影响及机制研究。方法:1.参照人类SMARCAL1基因mRNA序列设计、化学合成siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 三条 siRNA 及一条 Negative control 序列。选择 40nM 作为 siRNA的转染终浓度,转染后检测SMARCAL1 mRNA及Smarcal蛋白表达变化。2.采用CCK-8 检测法、EdU 染色法观察 Blank control 组、si-SMARCAL1组、Negative control组HEK293胚肾细胞的增殖情况,流式细胞仪观察三组HEK293胚肾细胞凋亡情况。3.通过转录组测序技术检测si-SMARCAL1组与Negative control组HEK293胚肾细胞中差异表达基因,采用GO功能分析及KEGG富集分析对差异表达基因进行分析筛选;应用实时荧光定量PCR对差异基因进行验证。4.通过荧光定量PCR技术分别检测 Negative control 组、si-SMARCAL1组HEK293 胚肾细胞中 KLF4、Nephrin、P53、Bax、Caspase3、Bcl-2 mRNA 的表达水平。5.通过 Western Blot 技术分别检测 Negative control 组、si-SMARCAL1 组 HEK293 胚肾细胞中 KLF4、Nephrin、P53、Bax、Caspase3、Bcl-2 蛋白表达水平。结果:1.将 Negative control（NC）组和 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 这 3 条靶向SMARCAL1的siRNA转染HEK293胚肾细胞,72小时后检测四组HEK293胚肾细胞60%以上细胞出现荧光,提示转染成功。SMARCAL1 mRNA相对表达水平,提示siRNA-1组细胞SMARCAL1沉默效率最好。同时分别检测四组HEK293胚肾细胞中Smarcal1蛋白表达水平,同样siRNA-1组干扰效果最好,蛋白水平降低最显著。2.Blank control 组、Negative control 组、si-SMARCAL1 组细胞培养第 24h、48h、72h及96h时,si-SMARCAL1各时间点的CCK-8法光吸收值均明显低于Blank control组和 Negative control 组（P＜0.001）。3.Blank control 组、Negative control 组、si-SMARCAL1组细胞培养3天后,EdU染色法显示,si-SMARCAL1组的细胞增殖率和细胞增殖数量较Blank control组、Negative control组显著降低（P＜0.001）。4.流式细胞检测凋亡情况示,si-SMARCAL1组与Blank control组、Negative control组相比,凋亡率有显著升高（P＜0.001）。5.转录组测序筛选SMARCAL1基因沉默后差异基因,共筛选出7398个差异表达基因。其中401（5.4%）个基因表达上调,6997（94.6%）个基因下调。6.通过差异表达基因的GO（Gene ontology）功能及KEGG信号通路富集分析,绘制差异表达基因火山图,显示大部分差异表达基因下调,其中包括上皮分化相关核心受体以及核心转录因子GLI3、GLI4、SOX13、KLF4,提示SMARCAL1可能通过以上途径参与发病机制。其中基于FPKM值和改变倍数综合考虑分析,KLF4可能是SMARCAL1发病机制中的关键因子之一。7.KEGG通路富集分析差异基因,结果显示si-SMARCAL1组介导的差异基因表达,与干细胞分化潜能相关的多能干型调控信号通路,与细胞增殖、分化和凋亡相关的Notch、Wnt及P53通路,与控制器官发育、增殖、分化相关的Hippo通路均呈显著负富集。结果表明,SMARCAL1可能与肾脏上皮分化有关,其功能缺失可能使得肾脏功能相关细胞分化增殖受阻、凋亡增加,造成肾脏功能损伤。8.si-SMARCAL1组、Negative control 组 HEK293 胚肾细胞中 KLF4、Nephrin、P53、Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表达结果显示si-SMARCAL1组KLF4、Nephrin、Bcl-2 mRNA表达明显低于Negative control 组（P＜0.001,P＜0.001,P=0.005）,si-SMARCAL1 组 P53、Caspase-3、Bax mRNA 表达显著高于 Negative control 组（P=0.013,P＜0.001）。9.si-SMARCAL1组、Negative control 组 HEK293 胚肾细胞中 KLF4、Nephrin、P53、Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达结果显示si-SMARCAL1组KLF4、Nephrin、Bcl-2蛋白表达明显低于 Negative control 组（P＜0.001,P＜0.001,P=0.005）,si-SMARCAL1 P53、Caspase-3、Bax 蛋白表达显著高于Negative control 组（P=0.013,P＜0.001）。结论:1.siRNA-1组沉默SMARCAL1基因导致Smrcal1蛋白水平降低最为显著,故选择siRNA-1组胚肾细胞株进行后续实验。2.SMARCAL1基因表达下降可以导致HEK293胚肾细胞凋亡增多,增殖受到抑制。3.通过生物信息分析,KLF4基因是SMARCAL1基因突变导致疾病的关键因子之一,同时与细胞凋亡及肾损伤的发生机制高度关联。4.首次证实SMARCAL1表达降低导致KLF4的表达下降,Nephrin表达下降是SIOD患儿肾损伤发生的机制之一。5.首次证实SMARCAL1表达降低导致KLF4的表达下降,P53表达增多,从而直接或者间接的促进Caspase-3、Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达,是介导HEK293胚肾细胞凋亡增加、增殖降低的重要机制。