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目的:鞘氨醇激酶(sphingosine kinases,SphK)作为关键酶调节着S1P/Cer的动态平衡,其中,S1P具有促生长作用,Cer具有促凋亡作用。目前研究表明S1P与多种细胞因子相互作用,但由于S1P的限速酶SphK在肝纤维化中的具体作用与机制目前尚不十分清楚。本研究旨在检测SphK在肝纤维化中的具体作用,探讨SphK具体是通过哪些分子机制参与肝纤维化的发生发展,为肝纤维化的诊断和治疗提供理论基础。 方法: 1、本研究通过WT小鼠与SphK1-/-两种小鼠,分别利用CCl4与BDL两种常见的肝纤维化诱导模型,拟在动物水平通过检测SphK1的蛋白水平与RNA水平的表达情况,来探索SphK1与肝纤维化的相关性; 2、在细胞水平,利用LX-2细胞系,分别加入SphK1 siRNA和SphK1抑制剂5C,检测肝星状细胞的活化情况以及AKT磷酸化水平; 3、通过Chemokine Array筛选目标趋化因子,探索哪一个趋化因子与SphK1之间存在直接的作用,然后通过原代细胞提取,将小鼠肝内肝星状细胞提取出来,验证趋化因子表达; 4、通过基因测序筛选出与趋化因子受体相对应的microRNA,然后在靶细胞上检测microRNA的表达,并验证SphK1与microRNA之间的关系; 5、为验证SphK1主要通过调控肝星状细胞来参与肝纤维化进程,本实验通过骨髓移植构建肝内KC中特异性敲除SphK1小鼠模型; 6、通过SphK1抑制剂对肝纤维化小鼠进行治疗,检测动物水平SphK1抑制剂是否能够减弱肝纤维化的发生与发展。 结果: 1、通过检测人体与小鼠的肝纤维化的标本与血清,我们发现SphK1在纤维化样本中表达明显增加; 2、Chemokine Array的结果发现CCL2在SphK1-/-小鼠肝脏中表达较WT小鼠有明显的下调; 3、基因测序结果显示microRNA-19b-3p在SphK1-/-小鼠肝脏中表达较WT小鼠有明显的上调,并且Targetscan等网络数据库比对发现microRNA-19b-3p能够调控CCL2受体CCR2的表达。同时,我们通过原代星状细胞提取验证了上述结果。 4、通过细胞水平,我们发现LX-2细胞中加了SphK1的抑制剂或是进行了SphK1的siRNA之后,肝星状细胞的活化明显下调,并且p-AKT表达也明显下调,提示SphK1是通过p-AKT发挥调控肝星状细胞活化的作用。 5、对原代肝星状细胞进行Transwell实验发现: (1)SphK1敲除抑制KC中CCL2的分泌减, (2)SphK1敲除抑制HSC与KC迁移, (3)SphK1敲除通过CCL2-CCR2信号轴抑制肝星状细胞活化, (4)SphK1敲除提高HSC中microRNA-19b-3p水平,抑制HSC活化。 6、骨髓移植结果提示:SphK1主要通过调控肝星状细胞来参与肝纤维化进程。 7、采用SphK1特异性抑制剂5C对CCl4诱导的小鼠进行治疗,结果发现:5C治疗6周后,小鼠肝脏炎症和纤维化程度明显减轻。 结论:本研究结果有助于明确肝纤维化发生的具体机制,同时证明SphK1潜在的治疗肝纤维化的作用,可能为治疗肝纤维化提供一个新的靶点,有助于肝纤维化药物的分子研发。