论文部分内容阅读
目的：利用葛根素单克隆抗体,建立葛根素与大豆苷免疫亲和高效色谱敲除技术(IAC-HPLC)及大豆苷的icELISA分析方法。方法：1利用腹水诱导法生产葛根素单克隆抗体,通过ELISA测定抗体的效价等参数。2利用辛酸法纯化葛根素单克隆抗体,制备葛根素的免疫亲和层析柱。3利用蛋白纯化系统优化葛根素免疫亲和高效色谱(IAC-HPLC)敲除技术的主要参数：敲除液(双蒸水和PBS)、洗脱液(甘氨酸盐酸缓冲液和盐酸缓冲液)、孵育时间(0/10/20min)、上样时间(04/0.8/1.6 mL·min-1)、上样体积(0.33/0.5/1 mL)、洗脱液流速(0.5/15/2.5 mL·min-1)、洗脱液盐离子浓度(0.5/1/1.5 M)、洗脱液pH(2/3/4)；考察IAC-HPLC准确性、精密度。4高碘酸钠氧化法合成大豆苷的人工抗原,建立检测大豆苷的icELISA,利用免疫亲和高效色谱敲除技术敲除大豆中的大豆苷。结果：1经测定,腹水效价为1：64000,建立了抗体对葛根素的竞争抑制曲线,线性范围为1-10000 ng/mL,表明葛根素单克隆抗体制备成功。2经计算葛根素单克隆抗体与琼脂糖凝胶偶联比为8.3：1,免疫亲和层析柱对葛根素的最大载样量为16.8μg.mL-1,表明免疫亲和色谱柱制备成功。3对色谱柱洗脱参数的考察表明：葛根素在PBS中响应值较双蒸水中高,两种敲除液对敲除峰无显著影响,考虑减少体系的盐离子浓度选择双蒸水作为敲除液；洗脱液甘氨酸盐酸缓冲液与盐酸缓冲液比较,甘氨酸盐酸缓冲液pH稳定,洗脱效果好,选择甘氨酸盐酸缓冲液为洗脱液。对所选择的孵育时间、上样时间、上样体积、洗脱液盐离子浓度3因素考察发现以上条件改变未对洗脱峰产生显著影响。洗脱液(甘氨酸盐酸缓冲液)随着pH的升高(pH=4)洗脱能力下降,pH为2和3时洗脱能力相当,考虑pH过低对葛根素抗体与琼脂糖凝胶的偶联造成破坏,选择为洗脱液pH=3进行洗脱。洗脱液流速为1.5mL·min-1、2.5 mL·min-1 时洗脱峰型未发生明显改变,0.5mL/min时洗脱峰发生拖尾,考虑缩短实验时间选择洗脱液流速为2.5 mL.min-1。考察IAC-HPLC准确性、精密度均符合要求。成功建立免疫亲和高效色谱(IAC-HPLC)敲除技术并敲除了葛根中的四种成分：3-羟基葛根素、葛根素、邻羟葛根素-7-木糖苷、大豆苷。4紫外扫描光谱图显示大豆苷的人工抗原具有大豆苷和OVA的叠加特征,表明大豆苷人工抗原合成成功。建立测定大豆苷的icELISA,线性竞争范围为10 ng-10μg·mL-1,灵敏度为823 ng·mL-1,线性方程为：y=-0.0971n(x)+1.1512,R2=0.9914。准确性及重复性良好,孔间差变异系数<4.1%,板间差变异系数<6.3%,平均加样回收率为105.4%,可用于大豆苷样品检测。免疫亲和高效色谱(IAC-HPLC)敲除技术敲除大豆中的四种成分：大豆苷、黄豆黄素、染料木黄酮(染料木素)、大豆苷元。结论：成功建立了葛根素与大豆苷免疫亲和高效色谱(IAC-HPLC)技术,对葛根与大豆进行敲除,建立了测定大豆苷的ic-ELISA,为葛根素及大豆苷的富集提供可行的方法,对一抗多用进行有益探索。