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1.研究背景与目的外伤、肿瘤切除、先天性畸形等常造成机体软组织的缺损,如何有效地修复软组织缺损是目前组织工程领域的重点和难点。随着干细胞技术的深入研究与发展,将干细胞作为种子细胞应用于修复软组织缺损是目前最有前景的方法。脂肪间充质干细胞(adipose stem cells, ASCs)由于具有来源丰富、取材方便、培养简单、具有多分化潜能且无伦理学障碍等优点,成为目前组织工程领域最受关注的种子细胞。但从脂肪组织中通过胶原酶消化、过滤、离心等步骤获得的脂肪组织来源血管基质成分(Stromal Vascular Fraction, SVF),并不是单纯的ASCs,而是一群混合细胞群体,经过2-3次的消化传代能得到一定的纯化,目前用于基础及临床研究的大部分都是这种非完全纯化的细胞。近年来,关于ASCs在脂肪组织中的原位起源(In Situ location)及SVF中亚细胞群的多向分化的报道增加。然而由于间充质干细胞没有特异的表面标志,到目前为止,关于ASCs在脂肪组织中的原位定位尚未确切定论。研究这一问题对于更好地将ASCs用于软组织修复至关重要。大量研究表明,脂肪细胞分化是一个受多种转录因子、生长因子及信号通路调控的非常精细且复杂的过程。其中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-Y(PPARY)在这一过程中起着关键的开启作用,它对体内脂肪组织的形成是必须的,敲除3T3-L1细胞中的PPARY基因会导致其丧失成脂分化能力,而且缺乏PPARY基因的小鼠胚胎也不能形成脂肪组织。Wnt信号通路是对细胞增殖以及间充质干细胞的成骨、成脂分化平衡起调控作用的重要通路,PPARY能否通过调控Wnt信号通路来促进脂肪细胞分化以及如何调控Wnt信号通路,目前尚不清楚。另外,胰岛素／胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1, IGF1)也是成脂分化过程必不可少的,虽然有文献报道IGF1与靶细胞膜上的特异性受体结合以后,能促进靶细胞的增殖和成脂分化,但对于IGF1在促进成脂分化过程中是否能影响Wnt信号通路及周围靶细胞,尚无相关报道。对这些问题的探讨有助于更有效地将IGF1应用于脂肪组织再生。本研究流式分选出SVF中的亚细胞群CD31-/CD34+/CD146+及CD31-/CD34+/CD146-,拟通过比较这两亚细胞群的体外增殖、成脂成骨分化能力及潜在的机制研究,寻找到具有更强成脂能力的种子细胞。同时,通过IGF1促进成脂的机制及应用研究,找到更有效的脂肪组织再生新方法。研究分为三个部分：不同细胞亚群体外增殖、多向分化能力的比较；PPARY-Axin2-Wnt信号通路在成脂分化过程中的机制研究；IGF1对Wnt信号通路和SVF中亚细胞群的影响,以及在促进脂肪再生中的应用研究。2.研究材料与方法(1)将新鲜的人脂肪组织做冰冻切片,免疫荧光检测CD31、CD34、CD146在脂肪组织中的分布情况。分离培养脂肪组织来源的SVF,通过流式细胞仪分选,将细胞分为CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亚群,重点分析两亚群在SVF中所占的比例,比较两者的增殖、成脂成骨分化能力,检测分化相关基因的表达。(2)比较对细胞的增殖及成脂成骨分化能力有重要调控作用的Wnt/β-catenin信号通路在细胞亚群中的强弱。检测亚群细胞中PPARY与Wnt对彼此的调控,并进一步检测PPARY与Wnt信号通路抑制剂Axin2的关系。过表达或干扰PPARY表达后,检测Axin2的基因表达。Axin2的启动子上有PPARY的结合位点,通过免疫荧光素酶报告系统分析此结合位点存在及切除后,转染PPARY对Axin2表达的影响。并检测干扰Axin2对ASCs成脂分化的影响。(3)体外检测IGF1对ASCs增殖、迁移及成脂分化的影响,分析用IGF1处理后的ASCs中CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-比例的变化,并检测IGF1对CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亚群细胞的增殖、成脂分化及Wnt活性的影响。用微球作为IGF1的缓释载体,将含有微球的PLGA支架材料移植入C57B16小鼠腹股沟的脂肪垫处,4周后检测支架中脂肪组织生长情况。3.研究结果(1)免疫荧光结果显示,CD34+的细胞主要分布在脂肪组织的血管周围；CD146+的细胞在血管壁上以及广泛地分布于脂肪周围结缔组织中,在血管周围存在CD34与CD146的共定位；CD31+的细胞主要分布在血管腔内,有少量与CD146共定位,故在脂肪组织的血管周围确实存在两群细胞CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-。流式结果显示第一代的SVF中CD31-/CD34+/CD146+的比例明显高于CD31-/CD34+/CD146-,两亚群在SVF中的比例都会随着细胞传代而降低,但在CD31-/CD34+的细胞中,CD146-的比例下降,CD146+的比例升高。(2)两细胞亚群相比较,CD31-/CD34+/CD146+细胞的增殖能力强于CD31-/CD34+/CD146-,但CD31-/CD34+/CD146-具有很强大的成脂分化能力,而成骨分化能力较弱。成脂分化转录因子PPARY、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)及成骨分化相关基因Runx2、OCN、Collagen I的表达也证实了这一现象。对细胞增殖和多向分化有重要调控作用的Wnt/β-catenin信号通路在CD31-/CD34+/CD146+细胞中有更强的活性。(3)成脂分化过程中,转录因子PPARY与Wnt信号通路之间有负反馈调节作用,而与Wnt信号通路的抑制剂Axin2存在高度的线性相关。染色质免疫共沉淀等检测发现PPARY能直接调控Axin2的表达。这些结果表明PPARY通过促进Axin2的表达来下调Wnt信号通路,从而促进ASCs的成脂分化。(4) IGF1能诱导CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-细胞转化,且能促进两细胞亚群及SVF的增殖、迁移、成脂分化。通过PLGA支架材料将IGF1移植到小鼠体内,发现IGF1能诱导宿主脂肪组织中的ASCs的归巢,促进局部的脂肪组织再生。4.研究结论寻找最佳的种子细胞是干细胞在组织工程领域应用需要解决的关键问题之一。SVF中的CD31-/CD34+/CD146-具有更强的成脂分化能力,PPARY-Axin2-Wnt信号通路在其中起着非常关键的作用,PPARY能通过促进Axin2的表达来下调Wnt信号通路,从而促进ASCs的体外成脂分化；而IGF1能诱导CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-细胞转化,且能促进两细胞亚群及SVF的增殖、迁移、成脂分化,从而促进体内的脂肪组织再生。