第一部分:肺癌组织中树突状细胞和调节性T细胞浸润及分布　　目的：检测肺癌组织及外周血中树突状细胞（Dendritic cell，DC）亚群和调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）的浸润比例，探讨三种免疫细胞间的相关性及其临床意义。　　方法：收集14例肺癌患者手术切除的肺癌组织（Tumor tissue）和癌旁肺组织（Paratumor tissue），同时留取8例患者外周血和10例健康志愿者的外周血。肺癌、癌旁组织经过消化、研磨，密度梯度离心分选出单个核细胞群体。以HLA-DR+CD11c+Lineage-作为髓系树突状细胞（Myeloid DC，mDC）的分子标记， HLA-DR+CD123+Lineage-作为淋系树突状细胞（Plasmacytoid DC，pDC）的分子标记， CD4+CD25+CD127-作为调节性T细胞（Regulatory T cells， Treg）的分子标记。应用流式细胞术（Flow Cytometry，FC）检测上述标本中DC和Treg的浸润及其表面趋化因子受体表达情况。应用 RT-PCR技术检测肺癌组织和癌旁组织中相关趋化因子mRNA表达情况。　　结果：肺癌组织、癌旁组织及外周血中均可检测到 CD4+CD25+CD127-Treg、HLA-DR+CD123+Lineage-mDC和HLA-DR+CD11c+Lineage-pDC的浸润表达。　　1．肺癌肿瘤浸润单个核细胞（Tumor infiltrating mononuclear cell，TIMC）中Treg比例为(7.11±2.77)%，癌旁组织单个核细胞（Para-tumor infiltrating mononuclear cell， PIMC）中浸润Treg比例为(2.95±0.55)%，肿瘤组织中Treg比例明显高于癌旁组织，两组间差异有统计学意义，p﹤0.05。Ⅲ～Ⅳ期肺癌肿瘤组织中Treg细胞比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期，p﹤0.05。癌旁正常肺组织中Treg细胞在各期肺癌中的比例无明显差异， p﹥0.05。淋巴转移组的肺癌患者Treg细胞比例显著高于未转移组，p﹤0.05。在不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、病理类型的患者中，Tr e g的浸润比例差异无统计学意义。　　2．肺癌肿瘤组中 pDC细胞比例为（3.49±2.04）%，癌旁组织中 pDC细胞比例为（0.89±0.67）%，肿瘤组织中 pDC细胞比例明显高于癌旁组织，两组间差异有统计学意义，p﹤0.05；肺癌组织中mDC细胞比例为（1.24±0.98）%，癌旁组织中mDC细胞比例为（0.90±0.86）%，肿瘤组织中mDC细胞比例和癌旁组织相比无明显差异， p﹥0.05；Ⅲ～Ⅳ期肺癌肿瘤组织中 pDC细胞比例较Ⅰ～Ⅱ期明显增高(4.59±0.85)vs(2.40±0.42)，差异有统计学意义，p﹤0.05。Ⅲ～Ⅳ期肺癌肿瘤组织中mDC细胞的比例和Ⅰ～Ⅱ期相比(1.37±0.46)vs(1.10±0.31)，差异无统计学意义，p﹥0.05。伴有淋巴结转移的肺癌组织中 pDC浸润比例明显高于不伴淋巴结转移的肺癌组织(5.20±1.01)vs(2.54±0.39)，差异有统计学意义，p﹤0.05；伴有淋巴结转移的肺癌组织中mDC浸润比例不高于淋巴结未转移的肺癌组织(1.38±0.36)vs(1.16±0.38)，差异无统计学意义，p﹥0.05。在不同的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、病理类型组的患者中，mDC和pDC的浸润比例差异无统计学意义p﹥0.05。　　3.其中有8例患者同时取得了肺癌组织、癌旁组织和外周血。结果发现在上述三种标本中，Treg的比例分别为（6.95±1.14）%、（3.10±0.15）%和（2.10±0.27）%；pDC的比例分别为（3.18±0.85）%、（0.76±0.18）和（1.02±0.16）%；mDC细胞的比例分别为（1.38±0.40）%、（1.13±0.33）%和（1.00±0.17）%。肺癌组织中Treg、pDC浸润比例均明显高于癌旁肺组织和外周血，且二者呈正相关性，p﹤0.05。而mDC在肿瘤组织、癌旁正常组织及外周血相比无明显差异。提示肺癌肿瘤微环境中Treg和pDC两种细胞存在聚集倾向。　　4.和相应外周血相比，肿瘤浸润Treg表面CCR4、CCR6和CXCR1表达率明显上调，而其相应配体CCL20、CCL22和CXCL8mRNA等在癌旁组织中也明显增高。提示 Treg在肺癌组织中的聚集存在趋化动力。而上述趋化因子受体在肿瘤浸润及外周血pDC中均无明显表达。　　5.肺癌组织较癌旁组织中 CD4+/CD8+T淋巴细胞比值上调（2.52±0.23）% vs（1.91±0.11）%，p﹤0.05。而且肺癌组织中CD4+/CD8+T细胞比值和Treg浸润比例呈正相关关系，提示Treg可能影响了CD4+/CD8+T细胞的极性改变。　　结论：肺癌肿瘤微环境中pDC和Treg的浸润比例明显高于癌旁组织和患者外周血，提示两种细胞肿瘤微环境中的集结存在一定的关联，pDC可能通过某种方式对Treg的数量和功能产生影响；定向迁移可能是Treg在肺癌肿瘤微环境中聚集的重要机制之一。pDC、Treg和CD4+/CD8+T细胞比值失衡相关联，提示肺癌肿瘤微环境中的免疫细胞已经出现朝着有利于肺癌发生免疫逃逸的方向转变。　　第二部分:肺癌恶性胸水中DC和Treg的表型特征、生物学功能及其与肺癌肿瘤免疫逃逸相关机制初探　　目的：检测肺癌恶性胸水微环境中Treg和DC亚群的表型特征、生物学功能及其和胸水微环境的关系。探讨pDC诱导Treg增殖的能力和相关机制。　　方法：收集18例晚期肺癌恶性胸水及患者外周血、10例结核性胸膜炎良性胸水和健康对照组外周血。制备胸水单个核细胞悬液。在标记确认DC亚群和Treg分子标志的基础上加标PD-1、PD-L1及相关抗体，检测Treg表面 PD-1分子和DC表面PD-L1分子的表达比例，分析PD-1+Treg与PD-L1+pDC和PD-L1+mDC的相关性。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent test;enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测患者外周血及胸水上清中相关细胞因子 TGF-β、IL-10和IFN-γ的浓度，并探讨细胞因子浓度和Treg、DC浸润比例之间的相关性。应用流式细胞仪无菌分选恶性胸水中pDC和Treg，探讨pDC诱导Treg增殖的能力及其相关机制。　　结果：1.恶性胸水及其外周血中 Treg的浸润比例分别为（13.04±4.31）%和（2.64±0.76）%，Treg表面PD-1分子表达比例分别为（18.64±6.93）%和（3.49±2.45）%，肺癌恶性胸水Treg比例及其表面PD-1的比例均明显高于其外周血。　　2.肺癌恶性胸水和外周血中pDC的浸润比例分别为（6.27±2.65）%和（1.29±0.55）%；pDC表面PD-L1分子的表达率分别为（31.93±8.56）%和（5.60±3.74）%；肺癌恶性胸水和外周血中 mDC的浸润比例分别为（0.52±0.26）%和（1.26±0.54）%， mDC表面PD-L1分子的表达率分别为（14.39±8.43）%和（15.66±6.61）%。肺癌恶性胸水中pDC及其表面PD-L1分子表达比例明显高于其外周血，而mDC及其表面PD-L1分子表达比例在恶性胸水及外周血之间相比无明显差异。　　3.相关性分析显示：PD-1+Treg/Treg比值和PD-L1+pDC/pDC的比值呈正相关关系（Y=0.6890*X+19.09， R2=0.3107， p=0.0162）， PD-1+Treg/Treg比值和PD-L1+mDC/mDC比值无明显相关性（Y=-0.4359*X+22.52，R2=0.1282，p=0.1445），提示pDC和Treg的增加存在一定的关联，可能和PD-1/PD-L1信号途径有关。　　4. ELISA检测结果显示，恶性胸水上清、胸水患者外周血、结核性胸水上清和健康志愿者外周血中 IL-10含量分别为（432.8±96.7） ng/L、（261.7±36.3） ng/L、（154.2±19.1）ng/L和（171.7±21.3）ng/L，TGF-β含量分别为（76.6±32.3）ng/L、（30.07±15.9）ng/L、（20.6±13.8）ng/L和（15.78±12.6）ng/L，IFN-γ含量分别为（45.6±12.4）ng/L、（229.3±68.6）ng/L、（688.9±236.8）ng/L和（444.5±113.8）ng/L，和外周血、良性胸水相比，肺癌恶性胸水中 IL-10、TGF-β表达增加，IFN-γ表达减少，相关性分析显示，胸水浸润Treg比例和IL-10含量呈正相关，和IFN-γ呈负相关， pDC和胸水细胞因子含量无明显相关性，提示恶性胸水中负性抑制性细胞因子存在上调表达。　　5.细胞增殖和抗体阻断试验结果发现：空白对照组、DC诱导组、抗体阻断组和同型对照组增殖细胞 OD值分别为（0.38±0.02）、（0.63±0.06）、（0.36±0.05）和（0.35±0.03）。IL-10表达率分别为（0.38±0.02）%、（0.63±0.06）%、（0.36±0.05）%和（0.35±0.03）%。TGF-β表达率分别为（11.02±1.75）%、（8.70±3.94）%、（12.73±2.48）%和（8.37±3.49）%。与空白对照组及抗体阻断组相比，DC诱导组和同型对照组细胞OD值及IL-10表达水平均明显提高，提示恶性胸水分离纯化的pDC可以有效诱导Treg的增殖和IL-10的分泌，在加入antiPD-L1后， pDC诱导Treg增殖和IL-10的分泌的能力明显减弱，提示PD-1/PD-L1信号途径在pDC诱导Treg增殖的过程中扮演了重要角色。　　结论：恶性胸水微环境中pDC和Treg浸润比例增加并存在正相关性，体外实验证实 pDC可以诱导 Treg增殖和 IL-10分泌，PD-L1抗体可以阻断这一效应。提示PD-1/PD-L1信号途径是导致肺癌恶性胸水微环境中pDC和Treg上调的重要影响因素。Treg增殖和分泌功能活化可能导致胸水中IL-10含量的进一步增加，加速营造了恶性胸水中相对“负性”的肿瘤微环境。上述变化可能诱导更多的免疫抑制性细胞群体的活化、效应细胞的极性转化甚至抑制肿瘤杀伤细胞的功能，进而有利于肺癌细胞发生免疫逃逸。　　第三部分:肺癌组织中pDC和Treg细胞浸润的临床意义　　目的：检测pDC和Treg在非小细胞肺癌组织中的浸润表达及分布情况，分析两种细胞浸润和肺癌患者临床病理参数的相关性，探讨其在判断患者生存预后中的价值。　　方法：以BDCA2作为肿瘤浸润pDC的分子标记，Foxp3作为肿瘤浸润Treg的分子标记。利用免疫组织化学染色方法对离体肺癌组织石蜡包埋标本中浸润的 pDC和Treg进行检测。利用Kaplan-Meier曲线计算患者的累积生存率，构建Cox模型对影响患者生存预后的因素进行预测。　　结果：1.肺癌组织中可检测到胞浆和胞核均呈棕色颗粒的 Foxp3+细胞，该群细胞主要分布在肿瘤细胞区域外以及癌巢边缘区域。Foxp3+Treg细胞在肿瘤组织中的阳性表达率高于癌旁组织〔（18.63±16.67）cells/HPF vs（2.96±2.97）cells/HPF〕，通过统计分析得到Foxp3+Treg浸润表达的中位数为13 cells/HPF；得出Foxp3+Treg大于13 cells/HPF高强度表达在Ⅲ～IV期和Ⅰ～Ⅱ期患者中的比例分别为22（30）例和17（48）例，卡方检验显示差异有统计学意义，p﹤0.05；在淋巴结转移组和未转移组的比例分别为21（32）例