丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植物,具有活血祛瘀,通经止痛,清心除烦等功效,在临床上被广泛应用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎症的治疗。近年来,丹参作为植物次生代谢途径研究的理想材料,被誉为“模式药用植物”。伴随着丹参药材需要量的日益扩大和规范化种植的需求,提高丹参中活性成分的含量、培育优良新品种已经成为丹参药材生产中亟待解决的关键问题之一。丹参中主要次生代谢产物分为两大类:一类为脂溶性的丹参酮类物质,包括丹参酮IIA、隐丹参酮等;另一类为水溶性的酚酸类化合物,包括咖啡酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B等。基于传统中药以水煎服的用药方式,以迷迭香酸和丹酚酸B为代表的水溶性酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的主要活性物质基础,受到研究者们的普遍关注。目前丹参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径己较为清楚,该途径上多数酶基因已被克隆,它们参与丹参酚酸类化合物合成的功能也初步明确,但这些酶基因的调控基因还不清楚,丹酚酸B等活性物质生物合成和积累的具体调控模式及分子机理尚无系统的研究报道。鉴于此,本论文在已有研究的基础上,采用基因表达谱(转录组学)结合代谢组学分析技术比较茉莉酸甲酯处理后丹参代谢网络中基因流和代谢流的变化规律,重点筛选影响酚酸类物质合成的关键调控基因,进一步采用基因转化及组合调控策略提高丹参中酚酸类活性成分的含量,阐明活性成分高效积累的调控模式和分子机理。主要的研究内容及结果如下:].建立了基于色谱-质谱联用技术的丹参代谢组学研究方法基于GC-MS和LC-MS技术建立了丹参代谢组学研究方法,优化了丹参样品提取、衍生化处理方法及测试条件,方法学研究表明建立的方法重复性好、灵敏度高,适用于快速的高通量检测;在设定的测试条件下,共检测到132个初生代谢产物和150个次生代谢产物,主要包括小分子有机酸、氨基酸、脂肪酸、寡糖、酚酸和丹参酮类化合物。2.分析了外源茉莉酸甲酯处理丹参基因表达谱和代谢谱的整体变化基于代谢组学研究策略和数字基因表达谱技术,从转录和代谢的不同层次系统比较了外源茉莉酸甲酯处理后丹参代谢谱和表达谱的变化,提取并鉴定了45个含量显著变化的标志性代谢产物,主要包括三羧酸循环中间产物、氨基酸、脂肪酸、寡糖、酚酸类和丹参酮类化合物;筛选出2131条差异表达的Unigene,包括45条丹参有效成分合成相关Unigene和42条差异表达转录因子基因;表达谱和代谢谱整合分析结果表明,茉莉酸甲酯作为一类非常重要的信号分子,不仅能够提高基础代谢的速率,而且能够有效诱导丹参次生代谢产物的迅速积累,对丹参初生代谢和次生代谢过程都具有显著影响;进一步运用相关性分析方法得到了MYB家族转录因子PAPl与丹参酚酸合成途径中酶基因表达之间的相关性,以及各基因表达与丹酚酸B积累之间的相关性,推测丹酚酸B生物合成存在[PAP]转录因子调控→PAL等关键酶基因表达→丹酚酸B积累]这样一种调控模式。3.获得了酚酸含量和抗氧化活性显著提高的丹参转基因株系.基于以上推测,在丹参中过表达拟南芥PAPJ转录因子,获得了 4个目标基因稳定整合并表达的阳性株系,表达量最高的转基因株系PAPl-14根中丹酚酸B含量可达73.27±1.68mg/g,是同时期对照株系的2.25倍(p<0.05);PAP1-14根提取物中总酚、总黄酮、花青素、木质素的含量均显著提高,抗氧化活性提高至对照的3.2倍。进一步结合表达谱和代谢组数据分析了 PAP1-14株系中显著变化的标志性代谢产物和差异表达基因,结果表明,PAP1转录因子通过激活苯丙烷代谢途径中A4L、C4H、4CL、RAS和酪氨酸代谢途径中TAT基因的表达,促进了酚酸类物质的合成积累,但并不影响丹参酮类化合物的含量;同时,PAP1过量表达还提高了酚酸合成的竞争途径——木质素代谢途径中关键酶基因CCR和COMT的转录水平,增强了木质素特异合成途径的代谢流。4.构建了多基因协同表达-干涉载体系统,以此为基础获得了丹酚酸B含量进一步提高至3倍的丹参优异资源建立了丹参多基因协同表达-干涉载体系统,通过一次转化实现了过表达PAPl转录因子并同时共干涉酚酸合成竞争性途径关键酶基因CCR和COMT的表达,获得了 2个丹酚酸B含量提高3倍的阳性株系(PCC-6和PCC-7);组织化学染色、光谱、色谱检测结果表明PCC-6和PCC-7植株中总木质素和S型木质素单体的含量显著降低,总酚、总黄酮含量提高,抗氧化活性增强;代谢组分析表明PCC-7株系中初生、次生代谢产物的动态变化与PAP1-14中代谢流的变化趋势相一致;表达谱结果表明,由于PAP1的转录激活作用,酚酸合成相关基因PAL、4CL、RCL、TAT、HPPR 表达均显著上调;由于COMT和CCR的表达被抑制,几乎所有参与木质素代谢的酶基因表达都显著下调,使原本合成木质素的代谢流偏向生成酚酸类化合物,是丹参酚酸类活性成分含量进一步提高的分子基础。本研究为丹参次生代谢产物合成调控、品质成因及分子育种等研究奠定了一定的基础,也为其它药用植物次生代谢产物调控的研究提供了新的思路。