莪术油注射液致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡及作用机制研究

来源 :广西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:majianfeipubin
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目的:探讨莪术油注射液对体外培养人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用,从细胞胀亡角度来考察细胞生长抑制的机制,并初步研究莪术油注射液诱导SKOV3细胞发生胀亡的分子机制。  方法:本实验以不同的药物浓度作用人卵巢癌SKOV3细胞株后,采用MTT法检测莪术油注射液对 SKOV3细胞的抑制增殖作用;通过倒臵显微镜观察细胞在培养液中的形态学变化;以荧光显微镜观察 AO染色后细胞核的形态变化;对细胞进行HE染色后通过光学显微镜观察细胞形态学变化;通过透射电镜观察细胞的超微结构变化和计数胀亡指数;通过DNA凝胶电泳观察细胞DNA断裂的特征;通过免疫组化法检测细胞bcl-2基因表达水平;通过全自动生化分析仪测定细胞培养液上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平;荧光染料2,7-二氯荧光素乙二酯、10-壬基吖啶橙结合荧光化学发光仪分别检测细胞内活性氧(ROS)及线粒体心磷脂(MTCL)水平。  结果:①莪术油注射液对SKOV3细胞体外生长具有明显的抑制作用,其抑制作用随浓度的增加而不断加强,呈现一定的量效关系,其中48h半数抑制浓度(IC50)为55.16ug/ml;②选择31.25、62.5、125μg/ml浓度的莪术油作用细胞48h后倒臵显微镜观察,大体可见细胞密度明显减少,胞体变长,细胞内颗粒感增强,细胞界限模糊,细胞间隙逐渐增宽,细胞质减少,胞浆减少,细胞脱落呈悬浮状,存活细胞减少,细胞核碎裂,可见细胞碎片,随着莪术油作用浓度的增加,上述现象更加明显;③选择31.25、62.5、125μg/ml浓度的莪术油作用细胞48h后荧光显微镜观察,主要变化为细胞肿胀,体积增大,胞膜面积缩小,核染色质分散扩大;④选择31.25、62.5、125μg/ml浓度的莪术油作用细胞48h后HE染色普通光镜观察,主要变化为细胞肿胀,体积增大,胞浆空泡化,胞浆内出现致密颗粒,胞质空泡化,内质网肿胀;细胞核内染色质分散,凝集在核膜、核仁周围,有时聚集成团块;胞膜起泡,通透性增加,细胞膜完整性破坏、胞膜崩解,最后细胞核溶解;⑤选择31.25、62.5、125μg/ml浓度的莪术油作用细胞48h后透射电镜观察,发现卵巢癌细胞胞体肿胀,细胞膜空泡化,细胞质出现虫蚀状和空泡化,粗面内质网扩张,线粒体肿胀,嵴破坏,数量减少,细胞核染色质分散,凝集在核膜、核仁周围,甚至核膜完整性破坏,结构崩解,核溶解性,细胞内容物逸出的典型胀亡细胞形态。其细胞胀亡指数(OI)随浓度的增加而增大,呈现一定的量效关系;⑥选择31.25、55.16、62.5、125μg/ml浓度的莪术油作用细胞48h后琼脂糖电泳结果,SKOV3细胞DNA条带均呈弥漫型;⑦免疫组化结果表明:各莪术油注射液组细胞中Bcl-2蛋白免疫组化染色综合得分与空白组比较下降,提示莪术油注射液具有下调Bcl-2蛋白表达的作用;⑧全自动生化分析仪检测结果表明:与空白组比较,各莪术油注射液组细胞培养液上清液乳酸脱氢酶数值均升高,并且随莪术油注射液剂量的增加而升高,提示莪术油注射液能使LDH从SKOV3细胞中漏出;⑨荧光化学发光仪检测结果表明:各莪术油注射液组SKOV3细胞内ROS的数值均增加,并且随莪术油注射液剂量的增大而增加,提示莪术油注射液具有增加细胞内ROS含量的作用;各莪术油注射液组SKOV3细胞内MTCL数值与空白组比较均下降,并且随莪术油注射液剂量的增加逐渐下降,提示莪术油注射液具有降低细胞内MTCL含量的作用。  结论:①莪术油注射液对 SKOV3细胞体外生长具有明显的抑制作用,抑制作用呈量效关系,其中48h半数抑制浓度(IC50)为55.16ug/ml;②莪术油注射液可使培养液中的SKOV3细胞出现细胞裂解现象,并随着莪术油注射液作用浓度的增加更加明显;③莪术油注射液导致SKOV3细胞出现细胞胀亡,胀亡指数有剂量依赖性;④莪术油注射液能下调Bcl-2蛋白表达;⑤莪术油注射液能促进LDH从SKOV3细胞中漏出,漏出量有剂量依赖性;⑥莪术油注射液能增加细胞内ROS含量,含量有剂量依赖性;⑦莪术油注射液能降低细胞内MTCL含量,含量有剂量依赖性。总之,莪术油注射液能导致体外培养的SKOV3细胞胀亡,并能下调细胞Bcl-2蛋白表达、促进LDH从细胞中漏出、增加细胞内ROS含量、降低细胞内MTCL含量。
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