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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,转移能力强,近20年来其死亡率增加了41.8%,严重影响人们的身心健康甚至危及生命。目前运用手术、放疗、化疗以及免疫等方法来治疗肝癌,患者的生存率有明显提高,但是这些治疗方法选择性低,靶向性差。因此,随着分子生物学的飞速发展,基因靶向治疗肝癌的研究越来越受到关注。
人端粒酶是一种核蛋白复合物,具有维持和延长真核细胞染色体末端端粒结构,调节细胞增殖潜能和寿命的功能。端粒酶有三个主要组成部分:RNA亚基(hTR),端粒酶相关蛋白1(hTP1),具有催化活性的端粒酶逆转录酶(hTERT)。近年来研究表明端粒酶在85%-95%的恶性肿瘤细胞中有表达,而在正常细胞中几乎不表达,这说明端粒酶是细胞永生化和癌变的关键步骤,因此抑制端粒酶的活性是恶性肿瘤基因治疗的理想靶点。另外,由于端粒酶的活性是通过激活hTERT而实现的,端粒酶的活性与hTERT的表达密切相关,hTERT是端粒酶中最重要的成分,在细胞癌变中起限速作用,因此hTERT成为最具有吸引力的肿瘤治疗的靶标。
以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗研究中,主要采用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术沉默hTERT基因,RNAi是生物进化过程中遗留下来的一种转录后通过RNA调控基因表达的机制。它通过小干扰RNA(smallinterferring RNA,siRNA)特异性地结合并降解靶向mRNA而起作用,siRNA是一种极具前景的基因靶向药物。本研究依据RNAi原理,以hTERT基因为靶点,用hTERT高表达的肝癌SMMC-7721细胞为研究对象,设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,通过体外转染肝癌SMMC-7721细胞,筛选出其有效序列,并观察其对细胞抑制生长效果,hTERT mRNA与蛋白表达情况及细胞凋亡情况,进一步探讨其机制,为肝癌的治疗探索一条新的途径。本研究内容如下:
第一部分:靶向hTERT siRNA有效序列的筛选根据GenBank中hTERT mRNA序列(AF015950)和siRNA设计软件,设计了6条21碱基的siRNA,化学合成法合成出双链siRNA,以Lipofectamin TM2000介导转染肝癌SMMC-7721细胞。分别采用SRB(磺酰罗丹明B)法,RT-PCR法评价其对细胞生长,hTERT mRNA表达的抑制作用。结果表明siRNA-2和siRNA-6能抑制SMMC-7721细胞的增殖及显著沉默hTERT基因,而其他四条无明显作用。
第二部分:RNA干扰抑制hTERT表达诱导SMMC-7721细胞凋亡在第一部分中,通过筛选,得到2条能高效抑制hTERT基因表达的siRNA:siRNA-2和siRNA-6。为了深入研究其机制,在此部分,这2条siRNA转染肝癌SMMC-7721细胞后,以PI单染法,检测它们对细胞周期的影响;以AnnexinV-FITC/PI双染法,检测它们对细胞凋亡的诱导作用;并以Western blot检测hTERT蛋白水平的变化及凋亡通路中Bcl-2,Bax,cyclin B1的表达水平,探讨凋亡产生的机制。结果表明有效序列siRNA能下调hTERT的表达,能迅速诱导SMMC-7721细胞凋亡,其机制主要是通过内源性凋亡途径中线粒体通路来实现。
结论:
1.以hTERT基因为靶点,设计合成了6条siRNA序列,从中成功筛选出两条有效序列siRNA,分别是hTERT-siRNA-2和hTERT-siRNA-6。
2.siRNA-2和siRNA-6转染细胞后能降低hTERT mRNA和蛋白的表达,证实了siRNA对SMMC-7721细胞中hTERT基因的序列特异性。
3.siRNA-2和siRNA-6转染SMMC-7721细胞后,能抑制细胞的生长,细胞周期发生阻滞,促进细胞凋亡,具有一定的体外抗肝癌作用,为肝癌的基因治疗提供实验基础。