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背景肝细胞肝癌是世界上排名第五位的恶性肿瘤,也是癌症相关的第三大死亡原因。虽然导致肝癌的各种遗传和表观遗传变化已经阐明,肝癌相关的分子机制仍在逐步研究中。microRNA(miRNA)是一类高度保守的短的非编码RNA,最近研究表明miRNA的表达异常在肝癌的发生发展中有重要作用。其中,MicroRNA-145(miR-145)尤为突出,这是由于其参与多个肿瘤的发生机制。目的研究miR-145对肝癌细胞生长的作用,探讨miR-145通过胰岛素受体底物-1(IRS1)及其下游AKT信号通路的作用机制。方法1.利用荧光定量PCR技术研究48对肝癌组织中miR-145和IRS1的表达情况,并统计分析两者的相关性。2.通过体外转染mimic的方法呈现miR-145的过表达趋势,在此基础上,通过细胞活力分析实验(CCK-8)、流式细胞术、平板克隆形成,研究miR-145对肝癌细胞增殖的影响。3.结合在线数据库进行rniR-145靶基因预测和挑选,利用Western Blot实验和荧光素酶双报告实验进行靶基因验证。4.通过体外转染小干扰RNA(siRNA)的方法呈现IRS1的低表达趋势,通过细胞活力分析实验(CCK-8)、流式细胞术、平板克隆形成,研究IRS1对肝癌细胞增殖的影响。5.利用Western Blot实验检测miR-145和IRS1对IRS1通路下游蛋白AKT,pAKT,FOXO1,pFOX01,和CyclinD1的表达水平的影响。6.采用IGF1刺激已进行体外转染miR-145mimic的肝癌细胞进行rescue实验,通过检测IRS1及其IRS1通路下游蛋白AKT,p AKT,FOXO1,pFOXO1,和CyclinD1的表达水平变化,验证miR-145对IRS1下游/AKT/FOXO1通路的作用。结果1.在收集的48例肝癌标本中,有34例为miR-145相对低表达,占70.8%；有32例为IRS1相对高表达,占66.7%.两者在肝癌组织中呈相反且相关的表达趋势。2.通过对Huh7和PLC细胞转染miR-145mimic,来过表达细胞中的miR-145.我们观察到miR-145可以抑制肝癌细胞增殖能力,诱导细胞发生G0/G1期周期阻滞,使细胞的集落生长能力和细胞活力降低降低。3.通过信息软件预测IRS1可能为miR-145的靶基因。荧光素酶双报告系统和western结果表明,IRS1是miR-145直接作用的靶点。对IRS1实施特异性沉默进一步证实了其在miR-145调控细胞增殖能力中的作用,IRS1siRNA转染的细胞株中CyclinD1、AKT、pAKT、FOX01、pFOX01的表达水平下降。4. Western blot结果显示miR-145转染的细胞株中CyclinD1、AKT、pAKT、 FOXO1、pFOXO1的表达水平下降,而miR-145引起的AKT/FOXO1磷酸化和CyclinD1表达下降,可被IGF-1刺激作用逆转。结论1.miR-145在肝癌组织中呈低表达,与IRS1的表达趋势相反。2.在Huh7和PLC细胞中恢复表达miR-145使其生长增殖能力下降。3.IRS1是miR-145的靶基因,miR-145通过靶向IRS1,影响AKT/FOXO1的磷酸化,降低cyclinD1表达,影响细胞生长。