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葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC1.1.3.4，GOD）是一种黄素蛋白（flavoprotein），以分子氧为电子受体将β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸内酯与过氧化氢。GOD在化学、制药、食品、饮料、临床诊断、生物技术等众多领域有广泛的应用，包括用于糖尿病检测的葡萄糖生物传感器、食品防腐剂以及颜色稳定剂等。目前GOD主要生产方式为利用微生物发酵生产，但仍存在诸多问题：1.现有报道产GOD的菌株产酶量较低；2.主要用于生产的霉菌发酵副产物较多，不利于分离GOD；3.对于产GOD工程菌株的研究仅限于实验室规模；4. GOD酶稳定性较差，特别是对过氧化氢的耐受性。这些问题都限制了GOD的进一步发酵生产和应用。本文以葡萄糖氧化酶GOD为研究对象，利用基因工程手段对重组发酵生产菌株进行改造，提高其分泌表达GOD的能力；同时，对GOD进行酶分子改造，提高GOD的酶学性质，并探索提高其应用稳定性的改造策略。主要研究结果如下：1.通过定性定量的方法从土壤中多轮筛选得到一株具有GOD活性的菌株，并对其进行分子生物学鉴定，通过在线数据库比对并配合系统进化分析，确认该菌株归属，将其命名为Aspergillus niger BBE11721。扩增获得了GOD的编码全长DNA序列，该序列包含一个开放编码可读框（ORF），由1818个碱基组成，共编码605个氨基酸，理论等电点IP为5.02，理论分子量为65.6kDa，并且前22位AA序列为A. niger菌株中天然信号肽序列。此后，将该基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统内进行了表达，成功构建了重组基因工程菌P. pastoris GS115(pPIC9K/GOD)。对分离纯化后的重组GOD进行了酶学性质研究，其最适反应pH为6.0，最适反应温度为35℃，动力学参数kcat，KmA与kcat/KmA分别为456.65s-1，38.95mM和11.72mM-1s-1。2.通过对A. niger与Penicillium amagasakiense、Penicillium variabile等来源的GOD序列进行比对，寻找造成不同来源酶活性保守区域内的差异氨基酸位点。在此基础上，将差异氨基酸进行突变，并且考察了改造前后重组酶学性质差异。通过对选定的14个氨基酸位点进行单点突变，单点突变后突变体D92Q、G131D、G539A和M578V的催化能力有所提高，kcat/KmA值分别提高至野生型rGOD的1.4、1.2、1.2和1.9倍。基于单点突变的结果，将4个突变位点以组合的方式进行了复合突变，通过分析酶动力学参数的变化，发现复合突变体D92Q-G539A-M578V的催化能力同野生型rGOD相比有较大的增幅，kcat/KmA值提高至rGOD的2.4倍。3.通过对A. niger来源过氧化氢酶（Catalase，CAT）的序列同源比对分析，发现其中CAT的区域B与区域D为活性功能区域。在复合突变D92Q-G539A-M578V的基础上，将CAT中的区域B和D分别同GOD的N端与C端进行融合。融合表达后，C端融合构建突变体的催化能力有所提高；而其他N端融合构建的突变体效果不显著。融合突变体GCCB和GCCD的kcat/KmA值增加至rGOD的2.8和2.4倍；与复合突变体D92Q-G539A-M578V相比，GCCB的kcat/KmA值进一步上升。融合区域B后，融合突变体GCCB在60℃下的温度稳定性有所提高，分别为重组rGOD、复合突变体D92Q-G539A-M578V的1.6和1.8倍；同时其耐氧化性增强，GCCB在100mM过氧化氢浓度下的半衰期为58min，为复合突变体D92Q-G539A-M578V的1.7倍。4.通过共表达P. pastoris来源不可折叠蛋白响应机制（UPR）激活因子HAC1基因，考察了其对GOD分泌表达的影响。结果显示，共表达HAC1基因能够有效的提高GOD在P. pastoris中的分泌表达，相比于原始菌株PP-GOD提高了37%。进一步研究培养温度对重组菌的影响时发现，不同于原始菌株PP-GOD仅适合低温培养的情况，共表达HAC1基因能够在P. pastoris最适生长温度28℃条件下，进一步提高GOD产量至1008U mL-1，相比原始菌株PP-GOD提高了3.1倍。通过对UPR下游靶基因转录水平变化的分析，发现使用该策略能够使内质网中处理新生肽链折叠的编码基因及内质网相关降解机制（ERAD）相关的功能基因的转录水平上调；同时，调节胞内活性氧（ROS）水平的氧化胁迫调控基因GCN4的转录水平上调，证实了共表达HAC1基因对于蛋白折叠机制的正向作用。5.通过对P. pastoris表达系统中蛋白折叠分泌途径及相关参与机制的分析汇总，将蛋白生产的代谢通路分为4个主要的模块，分别为：蛋白折叠模块，囊泡运输模块，ERAD模块及胁迫应激反应模块。研究了各模块基因改造对于重组菌发酵产GOD的影响，发现蛋白折叠模块中CNE1基因、囊泡运输模块中SEC53基因、ERAD模块中泛素连接酶编码HRD1基因、以及胁迫应激模块中GCN4基因对分泌外源GOD的作用较为明显。在此基础上，将不同功能模块基因进行组合优化，最终获得改造重组菌株S17。研究表明，该菌株的GOD活性达到1972.9U mL-1，平均qp达到0.971mg gDCW-1h-1，平均qp为原始菌株PP-GOD的2.3倍。通过对ROS水平及细胞存活率的测定，证实了改造策略能够有效提升宿主对于额外ROS胁迫的抵御能力。通过对改造菌株S17的5M3规模工艺放大，显示改造菌株S17生产GOD的能力较原始菌株PP-GOD显著提高，GOD产量达到1305.7U mL-1，为原始菌株的2.4倍。