烟草根结线虫病是危害烟叶生产重要的土传病害,在世界各国普遍发生,其中南方根结线虫对烟草的危害更为严重,每年都会造成巨大的经济损失。在生产中,选育抗病品种是防治根结线虫最经济、有效的方法。因此,鉴定烟草抗病品种,探究烟草对根结线虫的抗性机制具有重要的理论意义和应用价值。本试验在鉴定烟草对南方根结线虫抗性水平基础上,研究了不同抗性烟草(抗病烟草G28和感病烟草长脖黄)在南方根结线虫侵染后的生理生化指标的变化、病理组织观察巨型细胞的形态变化、Small RNA测序鉴定诱导产生的miRNAs、代谢组分析差异代谢途径,以揭示烟草抗南方根结线虫的抗性机制,为根结线虫的防治提供科学依据。本研究的主要结果如下:1.南方根结线虫侵染G28和长脖黄后表现出了明显不同的抗性反应。接种南方根结线虫后,G28的发病率和病情指数均为0;而长脖黄发病率为100%,病情指数为81.75。南方根结线虫侵染长脖黄,在寄主根部产生了大量的根结,须根生长量明显减少,严重影响了根系对水分和营养的吸收,造成烟叶产量降低、品质下降。而G28在南方根结线虫侵染下,没有根结产生,须根生长旺盛。因此,鉴定长脖黄为感病品种,G28为抗病品种。病理组织学观察显示,南方根结线虫侵染抗、感病烟草后造成根部组织细胞的超微结构发生显著的变化。南方根结线虫侵染感病烟草长脖黄后在根部建立取食位点,形成许多多核的巨型细胞,并且细胞质染色较深,细胞代谢旺盛。而在抗病烟草G28中则可以看到空泡和过敏性坏死细胞的产生。2.活性氧代谢和苯丙烷类代谢在烟草对南方根结线虫的抗性反应中扮演着重要角色。在南方根结线虫侵染下,G28中SOD、POD、CAT的活性显著高于长脖黄,并且MDA的含量显著低于长脖黄。表明G28在南方根结线虫胁迫下SOD、POD、CAT活性的提高能够快速清除活性氧的累积,以降低细胞膜脂的过氧化程度。苯丙烷类代谢相关酶PPO、PAL、TAL在线虫侵染后显著升高,并且抗病烟草G28的含量显著高于感病长脖黄。进一步说明,苯丙烷类代谢能够加速植物体内酚类物质、木质素和植保素等抗病次生物质的合成,以增强寄主植物的抗病能力,防止线虫的入侵。3.以烟草品种G28和长脖黄为材料,利用RNA-seq技术进行small RNA测序分析,鉴定根结线虫抗性相关的miRNAs。我们构建了 G28-CK、G28-RKN、Long-CK、Long-RKN 4个小 RNA 文库,分别产生了 30 682 255、24 066 860、26 047 385 和 21 909 545 条 sRNA 序列。这些sRNA序列长度分布在17-35个核苷酸范围内,主要集中在24个核苷酸的最多。将得到的clean reads定位到参考基因组,最终鉴定164个已知保守miRNAs分属于53个miRNA 家族和 1011 个新 miRNAs。4.通过GO功能注释和KEGG富集分析发现,miRNA的靶基因主要参与植物的生长发育、转录因子、植物激素信号转导、植物与病原互作。对筛选得到的9个显著差异表达的已知miRNAs进行qRT-PCR验证,以验证small RNA测序的准确性。在抗病烟草G28中筛选5 个显著差异表达的 miRNAs(miR398、miR399a、miR397、miR408、miR477a 和 miR827),可以作为烟草抗根结线虫研究的目标,并且在烟草防御南方根结线虫侵染过程中发挥着重要作用。5.以感病烟草长脖黄和抗病烟草G28为材料,采用LC-MS分析技术,探讨受南方根结线虫侵染后寄主在代谢组水平上的变化。通过PCA、OPLS-DA多元统计分析方法进行分类判别和潜在生物标志物的筛选。接种根结线虫后,分别在G28中鉴定了 77个差异代谢物,在长脖黄中鉴定了 87个差异代谢物。结果表明,烟草在与南方根结线虫互作过程中烟草应答反应强烈,代谢产物发生了明显的变化。6.鉴定出的生物标志物包括萜类、类黄酮、生物碱、芳香族氨基酸、磷脂类等植物抗逆境胁迫相关物质。研究结果表明寄主植物在根结线虫侵染后激活初级代谢和次级代谢物质,促进抗病物质的合成以抵抗根结线虫的入侵。差异代谢物的代谢通路富集分析显示,抗病烟草G28在南方根接线虫侵染下,引起氨基酸、激素、苯丙烷、莽草酸、氧化磷酸化和TCA循环等代谢途径产生了显著影响,在寄主与根结线虫互作过程中发挥着重要作用。