环酰亚胺水解酶（cyclic imide hydrolase, CIH, EC.3.5.2.16）是环酰胺酶（包括海因酶、二氢尿嘧啶酶、二氢乳清酸酶、尿囊素酶等）中的一个亚类,也称酰亚胺酶（imidase）。广泛分布于细菌、真菌和霉菌中。它参与细菌体内的环酰亚胺代谢,催化底物打开环酰胺键,生成相应的半酰胺,最终进入类似于TCA的代谢途径。Imidase是生产非天然的氨基酸、丙酮酸以及3-氨基甲酰-α-吡啶酸等有机酸的重要工业酶,受到了人们的广泛关注。锌离子是生物体内的一种重要的二价金属离子,也是很多金属酶及转录因子的辅因子,它不仅可以稳定蛋白的结构,也可以直接参与酶分子的催化。利用PAR与假单胞杆菌YZ-26来源的imidase竞争锌离子实验,显示PAR的浓度达到1mM时,imidase的剩余活力仅为16.6%,计算imidase的锌离子的结合常数为9.5×108M-1。为了研究imidase的锌离子结合位点,依据其同源建模结果,构建了一系列重组质粒pMAL-s-cih247、pMAL-s-cih7.108、pMAL-s-cih7、pMAL-s-cih108、pMAL-s-cih86、pMAL-s-cihi151,并转入BL21 （DE3）中,经终浓度为0.25mM的IPTG诱导后,37℃诱导培养3-5h后均为可溶性表达。酶活性分析揭示：突变酶H247/A、CC7,108/GG、C7／G、H86／A基本没有活性,C108／G保留了72%的酶活,而H151／G的活性相对于天然酶提高了约20%。菌体经超声破碎、Amylose亲和层析、ProScission Protease切割、硫酸铵沉淀及Sephacryl S-200凝胶层析获得电泳纯的蛋白。利用PAR的竞争实验,比较了不同imidase突变体蛋白的锌离子结合特征,揭示H247／A、H86／A、CC7,108／GG较野生型imidase竞争锌离子的能力明显降低,而突变体H151／G与PAR竞争锌离子的能力却略有提高。结合酶活性测定结果推测His86, His247和Cys7,108可能与锌离子的结合及imidase的催化活性密切相关。进一步对突变体的CD谱分析和对野生型imidase的晶体解析,肯定了His86、His90与Asp14为锌离子的结合位点,而His247与Tyr23是与底物结合的关键残基。半胱氨酸残基通常可以结合金属离子或作为酶的活性位点,还可通过形成二硫键在蛋白质结构和功能上发挥重要作用。对imidase中仅有的两个半胱氨酸残基的巯基基团进行DTNB修饰,并结合还原性及非还原性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,揭示了天然状态下,imidase中的两个半胱氨酸残基以游离形式存在,不形成链内及链间二硫键。进一步酶的聚合状态和锌离子结合实验显示：C108／G与野生型imidase相同,为具催化活性的四聚体结构且具有一定的锌离子结合能力；C7，108／G为多聚体状态,C7／G是单体和聚体的混合物,它们不再具有催化活性且不能结合锌离子。可以推断Cys7是维持酶分子构象的关键残基。