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作为一类重要的生命物质,酶不但在生命活动中行使着各种重要功能,而且在现代生物工业技术中也占有重要地位。本文主要研究了分枝杆菌中NADH焦磷酸酶(NudC)的功能和肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)中甘油脱水酶(glyceroldehydratase,GDH)其亚基之间相互融合后的酶学特征。在分枝杆菌NudC的研究中,比对不同分枝杆菌中NudC的氨基酸序列后,发现结核分枝杆菌H37Rv(MycobacteriumtuberculosisH37Rv,M.tuberculosisH37Rv)中的NudC与牛型分枝杆菌(MycobacteriumbovisBCG,M.bovisBCG)中NudC仅仅只有一个关键氨基酸(P237Q)不一样。而将临床分离的M.tuberculosis与M.bovisBCG中的NudC氨基酸序列进行比对,发现与M.bovisBCG中的NudC的相比较,临床分离的M.tuberculosis中的NudC在237,239,254和268位氨基酸有突变发生,其中发生突变频率最高的是237位氨基酸并发现临床分离株中此位点有回复突变发生。在本研究中分别克隆表达了M.bovisBCG和M.tuberculosisH37Rv中的NudC,体外和体内实验结果发现M.bovisBCG中的NudC具有水解NADH和NAD＋的能力,而M.tuberculosisH37Rv中的NudC基本上不能水解,并且发现237位氨基酸的突变影响NudC二聚体结构的形成。将M.bovisBCG和M.tuberculosisH37Rv中的NudC分别在耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatismc2155,M.smegmatismc2155)或M.bovisBCG中超量表达后发现M.bovisBCG来源的NudC能够导致M.smegmatismc2155或M.bovisBCG分别均对异烟肼(INH)和乙硫异烟胺(ETH)产生高耐药性,而来源于M.tuberculosisH37Rv的NudC超量表达后均没有影响。HPLC-ESI/MS结果表明来源于M.bovisBCG的NudC能够水解INH和NAD+形成的加合物INH-NAD,因此推测超量表达来源于M.bovisBCG中的NudC导致对INH耐药是通过一个新的机制,即NudC水解后的INH-NAD加合物不能再结合到INH的靶标蛋白InhA上而导致对INH耐药。由于ETH也能够与NAD+形成ETH-NAD加合物,因此推测NudC同样能够水解ETH-NAD加合物而导致对ETH耐药。在K.pneumoniaeGDH的研究中,发现纯化GDH时,组成GDH的α,β,γ三个亚基中的β亚基容易部分丢失,因此不利于对GDH的体外进化研究,为此在本研究中将β亚基和α或γ亚基融合(或在融合的亚基之间插入linker),结果发现α,β亚基融合后(并在之间插入(Gly4Ser)4连接肽段)和γ亚基共表达的融合酶GDHALB/C能够保持最佳的催化活性,并且具有与野生型GDH一样的特征即甘油能够导致酶迅速失活,而GDH的激活因子甘油脱水酶激活酶(GDHR)同样能够使失活的酶恢复酶活性。这种方式表达的蛋白不仅亚基不会丢失并且表达的蛋白不会因为亚基的融合而导致酶活性丧失,这对该酶的体外定向进化奠定了基础并对多亚基蛋白的表达提供了一定的参考价值。