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目的:探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的周期阻滞作用及相关机制,分析视网膜蛋白4(retinal protein4or uncoordinated119,UNC119)、Gsk3β/β-catenin途径与GA诱导细胞周期阻滞的相互作用。
方法:对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1,人肝细胞THLE-3进行体外培养,采用不同浓度GA(0.75μM,1.5μM和3μM)处理HCC细胞,通过蛋白印迹分析评估各细胞中UNC119蛋白表达情况,通过RT-PCR测定各细胞中UNC119的mRNA表达水平,通过MTT法评估GA对HCC细胞增殖的影响。选取人HCC细胞株Hep3B进行实验,分别用不同浓度GA(0.75μM,1.5μM和3μM)处理Hep3B细胞,通过流式细胞术(PI染色)分析细胞周期,通过蛋白印迹分析GA对细胞内细胞周期相关蛋白表达的影响,通过电泳迁移率变动分析(EMSA)评估GA对细胞内相关蛋白复合物的结合活性影响。采用UNC119的shRNA载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染Hep3B细胞建立UNC119沉默细胞系,采用UNC119的ORF载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染SMMC-7721细胞建立UNC119过表达细胞系,通过细胞周期分析、BrdU检测、蛋白印迹分析以及RT-PCR进一步评估UNC119在GA诱导细胞周期阻滞中的重要作用。构建裸鼠体内荷瘤模型,通过免疫组织化学分析进一步证实GA的抗肿瘤作用以及其分子机制。
结果:在本研究中,我们对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1,人肝细胞THLE-3进行体外培养,蛋白印迹分析显示HCC细胞中UNC119表达水平显著高于正常肝细胞,通过用GA处理HCC细胞发现GA对UNC119水平较高的HCC细胞的增殖抑制作用更强。此外,对Hep3B细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白的评估分析发现,在GA处理组中,停留在G1期的细胞明显增多,同时还观测到Hep3B细胞中细胞周期G1期相关调节蛋白如P-CDK2、P-CDK4、P-CDK6和cyclinA、cyclinD1、cyclinE水平的下降,而且GA对细胞周期的阻滞呈浓度依赖性。通过对Hep3B细胞核内β-catenin水平以及β-catenin/TCF复合物DNA结合活性的蛋白印迹分析发现,GA处理后的细胞细胞核内β-catenin表达水平下降,β-catenin/TCF复合物DNA结合活性被抑制。采用Gsk3β抑制剂LiCl处理细胞,发现LiCl可以逆转GA对细胞核内β-catenin的抑制作用。UNC119基因敲低或过表达实验进一步证明,UNC119参与GA对HCC细胞周期和Gsk3β/β-catenin信号转导的影响过程,在UNC119过表达实验中,UNC119还能使GA对HCC细胞的细胞周期阻滞效果减弱。在HCC裸鼠皮下成瘤动物模型实验中,GA显示出对肿瘤生长的明显抑制作用,与阳性对照紫杉醇组相比,在一定剂量内呈现体内低毒性。同时,肿瘤组织的免疫组化结果显示,GA处理组中UNC119、β-catenin和G1期相关蛋白水平显著下降,肿瘤组织Ki67染色实验结果发现GA对细胞增殖和相关蛋白表达水平的抑制作用。
结论:1、体外实验和体内实验均证明GA对HCC细胞和肿瘤的抑制作用,且呈现浓度依赖性,体内实验还证明GA的体内低毒性。
2、通过对GA处理的细胞的细胞周期分析显示GA通过抑制细胞G1期而导致细胞周期阻滞,从而发挥出抗肿瘤作用。
3、分析UNC119、Gsk3β/β-catenin以及GA对HCC细胞的细胞周期阻滞作用机制,得出GA通过激活Gsk3β活性而导致β-catenin被降解,从而使细胞核内β-catenin水平下降,再通过抑制β-catenin/TCF复合物结合活性而使下游基因不能表达,最终达到对HCC细胞的细胞周期阻滞作用,而发挥出抗肿瘤特性。
4、建立UNC119沉默细胞系与过表达细胞系,进一步验证UNC119基因在整个细胞周期阻滞机制中的重要作用。UNC119敲低可以产生类似GA的作用而使HCC细胞G1期停滞,UNC119过表达可以部分逆转GA的细胞周期阻滞作用。
5、UNC119、Gsk3β/β-catenin可能是GA诱导HCC细胞细胞周期阻滞的分子机制,且存在相互作用关系。
方法:对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1,人肝细胞THLE-3进行体外培养,采用不同浓度GA(0.75μM,1.5μM和3μM)处理HCC细胞,通过蛋白印迹分析评估各细胞中UNC119蛋白表达情况,通过RT-PCR测定各细胞中UNC119的mRNA表达水平,通过MTT法评估GA对HCC细胞增殖的影响。选取人HCC细胞株Hep3B进行实验,分别用不同浓度GA(0.75μM,1.5μM和3μM)处理Hep3B细胞,通过流式细胞术(PI染色)分析细胞周期,通过蛋白印迹分析GA对细胞内细胞周期相关蛋白表达的影响,通过电泳迁移率变动分析(EMSA)评估GA对细胞内相关蛋白复合物的结合活性影响。采用UNC119的shRNA载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染Hep3B细胞建立UNC119沉默细胞系,采用UNC119的ORF载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染SMMC-7721细胞建立UNC119过表达细胞系,通过细胞周期分析、BrdU检测、蛋白印迹分析以及RT-PCR进一步评估UNC119在GA诱导细胞周期阻滞中的重要作用。构建裸鼠体内荷瘤模型,通过免疫组织化学分析进一步证实GA的抗肿瘤作用以及其分子机制。
结果:在本研究中,我们对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1,人肝细胞THLE-3进行体外培养,蛋白印迹分析显示HCC细胞中UNC119表达水平显著高于正常肝细胞,通过用GA处理HCC细胞发现GA对UNC119水平较高的HCC细胞的增殖抑制作用更强。此外,对Hep3B细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白的评估分析发现,在GA处理组中,停留在G1期的细胞明显增多,同时还观测到Hep3B细胞中细胞周期G1期相关调节蛋白如P-CDK2、P-CDK4、P-CDK6和cyclinA、cyclinD1、cyclinE水平的下降,而且GA对细胞周期的阻滞呈浓度依赖性。通过对Hep3B细胞核内β-catenin水平以及β-catenin/TCF复合物DNA结合活性的蛋白印迹分析发现,GA处理后的细胞细胞核内β-catenin表达水平下降,β-catenin/TCF复合物DNA结合活性被抑制。采用Gsk3β抑制剂LiCl处理细胞,发现LiCl可以逆转GA对细胞核内β-catenin的抑制作用。UNC119基因敲低或过表达实验进一步证明,UNC119参与GA对HCC细胞周期和Gsk3β/β-catenin信号转导的影响过程,在UNC119过表达实验中,UNC119还能使GA对HCC细胞的细胞周期阻滞效果减弱。在HCC裸鼠皮下成瘤动物模型实验中,GA显示出对肿瘤生长的明显抑制作用,与阳性对照紫杉醇组相比,在一定剂量内呈现体内低毒性。同时,肿瘤组织的免疫组化结果显示,GA处理组中UNC119、β-catenin和G1期相关蛋白水平显著下降,肿瘤组织Ki67染色实验结果发现GA对细胞增殖和相关蛋白表达水平的抑制作用。
结论:1、体外实验和体内实验均证明GA对HCC细胞和肿瘤的抑制作用,且呈现浓度依赖性,体内实验还证明GA的体内低毒性。
2、通过对GA处理的细胞的细胞周期分析显示GA通过抑制细胞G1期而导致细胞周期阻滞,从而发挥出抗肿瘤作用。
3、分析UNC119、Gsk3β/β-catenin以及GA对HCC细胞的细胞周期阻滞作用机制,得出GA通过激活Gsk3β活性而导致β-catenin被降解,从而使细胞核内β-catenin水平下降,再通过抑制β-catenin/TCF复合物结合活性而使下游基因不能表达,最终达到对HCC细胞的细胞周期阻滞作用,而发挥出抗肿瘤特性。
4、建立UNC119沉默细胞系与过表达细胞系,进一步验证UNC119基因在整个细胞周期阻滞机制中的重要作用。UNC119敲低可以产生类似GA的作用而使HCC细胞G1期停滞,UNC119过表达可以部分逆转GA的细胞周期阻滞作用。
5、UNC119、Gsk3β/β-catenin可能是GA诱导HCC细胞细胞周期阻滞的分子机制,且存在相互作用关系。