论文部分内容阅读
目的：探讨藤黄酸（gambogic acid，GA）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞的周期阻滞作用及相关机制，分析视网膜蛋白4（retinal protein4or uncoordinated119，UNC119）、Gsk3β/β-catenin途径与GA诱导细胞周期阻滞的相互作用。
方法：对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1，人肝细胞THLE-3进行体外培养，采用不同浓度GA（0.75μM，1.5μM和3μM）处理HCC细胞，通过蛋白印迹分析评估各细胞中UNC119蛋白表达情况，通过RT-PCR测定各细胞中UNC119的mRNA表达水平，通过MTT法评估GA对HCC细胞增殖的影响。选取人HCC细胞株Hep3B进行实验，分别用不同浓度GA（0.75μM，1.5μM和3μM）处理Hep3B细胞，通过流式细胞术（PI染色）分析细胞周期，通过蛋白印迹分析GA对细胞内细胞周期相关蛋白表达的影响，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）评估GA对细胞内相关蛋白复合物的结合活性影响。采用UNC119的shRNA载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染Hep3B细胞建立UNC119沉默细胞系，采用UNC119的ORF载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染SMMC-7721细胞建立UNC119过表达细胞系，通过细胞周期分析、BrdU检测、蛋白印迹分析以及RT-PCR进一步评估UNC119在GA诱导细胞周期阻滞中的重要作用。构建裸鼠体内荷瘤模型，通过免疫组织化学分析进一步证实GA的抗肿瘤作用以及其分子机制。
结果：在本研究中，我们对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1，人肝细胞THLE-3进行体外培养，蛋白印迹分析显示HCC细胞中UNC119表达水平显著高于正常肝细胞，通过用GA处理HCC细胞发现GA对UNC119水平较高的HCC细胞的增殖抑制作用更强。此外，对Hep3B细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白的评估分析发现，在GA处理组中，停留在G1期的细胞明显增多，同时还观测到Hep3B细胞中细胞周期G1期相关调节蛋白如P-CDK2、P-CDK4、P-CDK6和cyclinA、cyclinD1、cyclinE水平的下降，而且GA对细胞周期的阻滞呈浓度依赖性。通过对Hep3B细胞核内β-catenin水平以及β-catenin/TCF复合物DNA结合活性的蛋白印迹分析发现，GA处理后的细胞细胞核内β-catenin表达水平下降，β-catenin/TCF复合物DNA结合活性被抑制。采用Gsk3β抑制剂LiCl处理细胞，发现LiCl可以逆转GA对细胞核内β-catenin的抑制作用。UNC119基因敲低或过表达实验进一步证明，UNC119参与GA对HCC细胞周期和Gsk3β/β-catenin信号转导的影响过程，在UNC119过表达实验中，UNC119还能使GA对HCC细胞的细胞周期阻滞效果减弱。在HCC裸鼠皮下成瘤动物模型实验中，GA显示出对肿瘤生长的明显抑制作用，与阳性对照紫杉醇组相比，在一定剂量内呈现体内低毒性。同时，肿瘤组织的免疫组化结果显示，GA处理组中UNC119、β-catenin和G1期相关蛋白水平显著下降，肿瘤组织Ki67染色实验结果发现GA对细胞增殖和相关蛋白表达水平的抑制作用。
结论：1、体外实验和体内实验均证明GA对HCC细胞和肿瘤的抑制作用，且呈现浓度依赖性，体内实验还证明GA的体内低毒性。
2、通过对GA处理的细胞的细胞周期分析显示GA通过抑制细胞G1期而导致细胞周期阻滞，从而发挥出抗肿瘤作用。
3、分析UNC119、Gsk3β/β-catenin以及GA对HCC细胞的细胞周期阻滞作用机制，得出GA通过激活Gsk3β活性而导致β-catenin被降解，从而使细胞核内β-catenin水平下降，再通过抑制β-catenin/TCF复合物结合活性而使下游基因不能表达，最终达到对HCC细胞的细胞周期阻滞作用，而发挥出抗肿瘤特性。
4、建立UNC119沉默细胞系与过表达细胞系，进一步验证UNC119基因在整个细胞周期阻滞机制中的重要作用。UNC119敲低可以产生类似GA的作用而使HCC细胞G1期停滞，UNC119过表达可以部分逆转GA的细胞周期阻滞作用。
5、UNC119、Gsk3β/β-catenin可能是GA诱导HCC细胞细胞周期阻滞的分子机制，且存在相互作用关系。
方法：对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1，人肝细胞THLE-3进行体外培养，采用不同浓度GA（0.75μM，1.5μM和3μM）处理HCC细胞，通过蛋白印迹分析评估各细胞中UNC119蛋白表达情况，通过RT-PCR测定各细胞中UNC119的mRNA表达水平，通过MTT法评估GA对HCC细胞增殖的影响。选取人HCC细胞株Hep3B进行实验，分别用不同浓度GA（0.75μM，1.5μM和3μM）处理Hep3B细胞，通过流式细胞术（PI染色）分析细胞周期，通过蛋白印迹分析GA对细胞内细胞周期相关蛋白表达的影响，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）评估GA对细胞内相关蛋白复合物的结合活性影响。采用UNC119的shRNA载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染Hep3B细胞建立UNC119沉默细胞系，采用UNC119的ORF载体转染HEK-293T细胞得到病毒上清液感染SMMC-7721细胞建立UNC119过表达细胞系，通过细胞周期分析、BrdU检测、蛋白印迹分析以及RT-PCR进一步评估UNC119在GA诱导细胞周期阻滞中的重要作用。构建裸鼠体内荷瘤模型，通过免疫组织化学分析进一步证实GA的抗肿瘤作用以及其分子机制。
结果：在本研究中，我们对人HCC细胞株Hep3B、MHCC-LM3、SMMC-7721、SK-Hep1，人肝细胞THLE-3进行体外培养，蛋白印迹分析显示HCC细胞中UNC119表达水平显著高于正常肝细胞，通过用GA处理HCC细胞发现GA对UNC119水平较高的HCC细胞的增殖抑制作用更强。此外，对Hep3B细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白的评估分析发现，在GA处理组中，停留在G1期的细胞明显增多，同时还观测到Hep3B细胞中细胞周期G1期相关调节蛋白如P-CDK2、P-CDK4、P-CDK6和cyclinA、cyclinD1、cyclinE水平的下降，而且GA对细胞周期的阻滞呈浓度依赖性。通过对Hep3B细胞核内β-catenin水平以及β-catenin/TCF复合物DNA结合活性的蛋白印迹分析发现，GA处理后的细胞细胞核内β-catenin表达水平下降，β-catenin/TCF复合物DNA结合活性被抑制。采用Gsk3β抑制剂LiCl处理细胞，发现LiCl可以逆转GA对细胞核内β-catenin的抑制作用。UNC119基因敲低或过表达实验进一步证明，UNC119参与GA对HCC细胞周期和Gsk3β/β-catenin信号转导的影响过程，在UNC119过表达实验中，UNC119还能使GA对HCC细胞的细胞周期阻滞效果减弱。在HCC裸鼠皮下成瘤动物模型实验中，GA显示出对肿瘤生长的明显抑制作用，与阳性对照紫杉醇组相比，在一定剂量内呈现体内低毒性。同时，肿瘤组织的免疫组化结果显示，GA处理组中UNC119、β-catenin和G1期相关蛋白水平显著下降，肿瘤组织Ki67染色实验结果发现GA对细胞增殖和相关蛋白表达水平的抑制作用。
结论：1、体外实验和体内实验均证明GA对HCC细胞和肿瘤的抑制作用，且呈现浓度依赖性，体内实验还证明GA的体内低毒性。
2、通过对GA处理的细胞的细胞周期分析显示GA通过抑制细胞G1期而导致细胞周期阻滞，从而发挥出抗肿瘤作用。
3、分析UNC119、Gsk3β/β-catenin以及GA对HCC细胞的细胞周期阻滞作用机制，得出GA通过激活Gsk3β活性而导致β-catenin被降解，从而使细胞核内β-catenin水平下降，再通过抑制β-catenin/TCF复合物结合活性而使下游基因不能表达，最终达到对HCC细胞的细胞周期阻滞作用，而发挥出抗肿瘤特性。
4、建立UNC119沉默细胞系与过表达细胞系，进一步验证UNC119基因在整个细胞周期阻滞机制中的重要作用。UNC119敲低可以产生类似GA的作用而使HCC细胞G1期停滞，UNC119过表达可以部分逆转GA的细胞周期阻滞作用。
5、UNC119、Gsk3β/β-catenin可能是GA诱导HCC细胞细胞周期阻滞的分子机制，且存在相互作用关系。