胸膜肺炎放线杆菌是引起猪出血性、纤维素性胸膜肺炎的高度传染性致死性病原菌，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型多且各个血清型交叉保护弱，给本病的预防和控制带来了巨大困难。本试验根据胸膜肺炎放线杆菌种特异性外膜脂蛋白基因（OmlA）和血清型1，2，6，7荚膜多糖生物合成基因（CPS）分别设计引物，建立各单重PCR并优化条件，然后在此基础上建立多重PCR，对其特异性和敏感性进行检测，并应用于临床病料检测。 1 引物设计 参考GenBank中胸膜肺炎放线杆菌OmlA基因和CPS基因序列，分析其同源性，用Array Designer2.0软件针对OmlA两端保守基因，血清型1，2，6，7 CPS特异性区域分别设计引物，并对设计出的引物进行二聚体、同源性，互补性分析，同时对扩增序列进行同源性和互补性分析，确定5对引物，预扩增OmlA 952bp，CPS₁ 630bp，CPS₂ 504bp，CPS₆ 720bp，CPS₇ 389bp片段。 2 单重PCR 利用设计的引物分别对OmlA基因，血清型1，2，6，7 CPS基因进行PCR扩增，优化Tm值，引物浓度，Mg²⁺离子浓度，并对敏感性和特异性进行检测。结果在如下体系10×buffer(Mg²⁺-Free)5μl，25mM Mg²⁺ 3μl-6μl，2.5mM dNTP4μl，25／2pmol／ul上下游混合引物1.5μl-3μl，5u／μl Taq DNA聚合酶0.4μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程序为94℃预变性4min，94℃变性45s，52℃-58℃之间复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存中都能扩增出预期的OmlA 952bp，CPS₁ 630bp，CPS₂ 504bp，CPS₆ 720bp，CPS₇ 389bp片段。对APP血清型1-4，6-10进行扩增，OmlA-PCR均能扩增出953bp片段，CPS₁，CPS₂，CPS₆，CPS₇ PCR分别只能扩增出预期的相应片段；对猪副嗜血杆菌、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增，各PCR均不能扩增出任何片段。对各PCR敏感性进行检测，均能扩增出10pg的DNA量。 3 多重PCR 在单重PCR基础上，通过优化退火温度，引物浓度，镁离子浓度，建立即可对APP进行定性检测又同时可对APP血清型1，2，6，7进行定型检测的多重PCR方法。其优化的体系为10×buffer(Mg²⁺-Free)5μl，25mM Mg²⁺ 4μl，2.5mM dNTP 4μl，25pmol／ul OmlA上下游混合引物2μl，其它型上下游混合引物各1.5ul，5u／μl Taq DNA聚合酶0.3μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程