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脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一种非常严重的脑卒中类型,常导致患者严重的神经功能缺失,预后不良。产生这些后果与出血后脑水肿形成关系密切。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)对多种神经系统疾病具有保护作用,包括ICH,但VEGF对ICH后脑水肿尚无研究。我们前期的研究证实,水通道蛋白4(aquaporin-4, AQP4)作为脑内含量最多的水通道蛋白,对ICH后脑水肿的清除起着重要作用。而且已有研究表明,两者可在血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏的星形胶质细胞终足上共表达,且脑内注入VEGF可诱导AQP4表达增加。既然两者之间有着密切联系,我们推测VEGF对ICH后脑水肿的影响可能与调节AQP4的表达有关。本课题首先探究侧脑室注入重组人VEGF165(recombinant human VEGF165, rhVEGF165)对野生小鼠ICH后神经功能缺损评分、脑组织含水量、BBB通透性和细胞凋亡的作用,以及对正常状态和ICH后脑组织AQP4表达的影响,然后通过与AQP4基因敲除小鼠比较,探讨rhVEGF165对ICH的上述作用是否与调节AQP4的表达相关。并进一步通过星形胶质细胞的离体培养,研究rhVEGF165影响AQP4表达可能的信号转导通路。本实验结果为VEGF下游信号通路、AQP4表达的调节及VEGF对ICH后脑水肿的影响机制提供理论依据,同时为治疗ICH后脑水肿提供双重作用靶点,可能为新药的研制提供新的思路。第一部分：VEGF对ICH后脑水肿的作用目的：研究侧脑室注入rhVEGF165对野生小鼠ICH后脑水肿的作用及脑组织AQP4蛋白表达的影响。方法：将CD1小鼠随机分为对照组、对照+VEGF(3μg/kg)组、假手术组、ICH组、ICH+VEGF组和ICH+VEGFR抑制剂SU5416(60μg/kg)组,在干预后3d对前5组进行神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、伊文思蓝(Evans blue, EB)法测定BBB通透性、TUNEL染色法评价细胞凋亡。并对各组用Western blot法和免疫荧光法检测正常纹状体或血肿周围AQP4蛋白表达。结果：1.侧脑室注入rhVEGF165在野生小鼠ICH后可显著减少神经功能缺损评分(p<0.05),减少脑组织含水量(p<0.01),减少血肿周围TUNEL阳性细胞数量(p<0.01),但不影响脑组织EB渗漏。2.Western blot结果显示,正常状态下侧脑室注入rhVEGF165可使纹状体AQP4蛋白表达明显增加(p<0.01)。ICH后侧脑室注入rhVEGF165也可使血肿周围AQP4蛋白表达增加(p<0.01),而给予SU5416可使血肿周围AQP4蛋白表达减少(p<0.01)。免疫荧光法显示AQP4蛋白的荧光表达数量及强度与Western blot结果相一致。结论：1.侧脑室注入rhVEGF165可在野生小鼠ICH后减轻脑水肿,改善神经功能,减轻细胞凋亡,但不影响BBB通透性。2.侧脑室注入rhVEGF165可上调ICH后血肿周围AQP4蛋白表达。ICH后AQP4蛋白表达增加可能与内源性VEGF有关。第二部分：AQP4在VEGF对ICH后脑水肿效应中的作用目的：研究侧脑室注入rhVEGF165对AQP4基因敲除小鼠ICH后脑水肿的作用,并通过AQP4+/+和AQP4-/-小鼠的对比,探讨rhVEGF165对ICH后脑水肿作用是否与调节AQP4的表达相关。方法：将AQP4-/-小鼠随机分为对照组、对照+VEGF组、假手术组、ICH组和ICH+VEGF组。在干预后3d对各组进行神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、EB法测定BBB通透性、TUNEL染色法评价细胞凋亡。结果：1.ICH后AQP4-/-小鼠神经功能缺损较AQP4+/+小鼠严重(p<0.05),侧脑室注入rhVEGF165可减轻AQP4-/-小鼠神经功能缺损(p<0.05),但仍较AQP4+/+小鼠严重(p<0,05)。且rhVEGF165降低ICH后AQP4+/+小鼠神经功能缺损评分的百分比显著高于AQP4-/-小鼠(p<0.01)。2.正常状态下侧脑室注入rhVEGF165可增加AQP4-/-小鼠脑组织含水量(p<0.01)。ICH后AQP4-/-小鼠脑水肿较AQP4+/+小鼠严重(p<0.05),侧脑室注入rhVEGF165不影响AQP4-/-小鼠脑组织含水量。3.正常状态下侧脑室注入rhVEGF165可使AQP4-/-小鼠EB渗漏增加(p<0.01),且较AQP4+/+小鼠更为严重(p<0.01)。ICH后AQP4-/-小鼠脑组织EB含量较AQP4+/+小鼠增多(p<0.05),侧脑室注入rhVEGF165可使AQP4-/-小鼠EB渗漏显著增加(p<0.05)。4.ICH后AQP4-/-小鼠血肿周围TUNEL阳性细胞数高于AQP4+/+小鼠(p<0.01),侧脑室注入rhVEGF165可减少AQP4-/-小鼠TUNEL阳性细胞数(p<0.01),但仍高于AQP4+/+小鼠(p<0.01)。且rhVEGF165使ICH后AQP4+/+小鼠TUNEL阳性细胞数降低的百分比显著高于AQP4-/-小鼠(p<0.01)。结论：1.ICH后AQP4表达增加可对神经功能、脑水肿、BBB完整性及细胞凋亡均起到保护作用。2.上调AQP4表达是rhVEGF165减轻ICH后神经功能缺损的机制之一。3.正常状态下AQP4有清除VEGF潜在引起脑水肿的作用。rhVEGF165减轻ICH后脑水肿的作用可能与增加AQP4表达,从而加强脑水肿的清除有关。4.正常状态下rhVEGF165有破坏BBB的效应,AQP4基因敲除可加重该效应。ICH后,rhVEGF165对BBB可能同时具有保护和破坏的作用,其保护作用可能与增加AQP4表达有关。5.上调AQP4表达是rhVEGF165减少ICH后血肿周围凋亡细胞数量的机制之一。第三部分：VEGF影响AQP4表达的信号转导通路目的：探讨rhVEGF165引起AQP4蛋白表达增高可能的信号转导通路。方法：将传代并鉴定后的星形胶质细胞随机分为正常对照组、VEGF (50ng/ml)组、VEGF+JNK抑制剂SP600125(20μM)组、VEGF+ERK抑制剂U0126(10μM)组、VEGF+p38-MAPK抑制剂SB239063(20μM)组、VEGF+PI3K抑制剂Ly294002(20μM)组。分别在加药后2d用Western blot和免疫荧光法检测各组AQP4蛋白的表达。结果：1.Western blot检测显示：rhVEGF165可使星形胶质细胞AQP4蛋白表达增加(p<0.01),该效应可被SP600125和U0126抑制(p<0.01),但不能被SB239063或Ly294002所抑制。2.免疫荧光法显示AQP4蛋白的荧光表达数量及强度与Western blot结果相一致。结论：1.rhVEGF165可使离体培养的星形胶质细胞AQP4蛋白表达增加。2. rhVEGF165可能通过激活JNK和ERK通路,而非通过激活p38-MAPK或PI3K通路使AQP4蛋白表达增加。