皮肤病已成为当今世界公认的最常见疾病及多发病之一,严重影响人类的身体健康。目前,氨基酸螯合钙经皮贴剂在临床上治疗皮炎湿疹类皮肤病,具有显著疗效,但其种类较少,亟待研发新药。牛磺酸螯合钙(Taurine chelate calcium,TCCa)是本实验室自主研发的钙制剂,其经皮吸收性能优于常用钙制剂,之前已完成制备及表征,并建立完善促透体系,但是TCCa在体内作用方式及药物修复机制尚未明确。因此,本文研究TCCa在体液中的稳定性及解离机理,并从细胞层面和基因层面阐明TCCa对皮肤屏障的修复机制,对于推动TCCa的临床应用具有重要的理论意义和实用价值。本文首先研究TCCa在体液中的稳定性及解离机理。采用分光光度法测定TCCa的稳定常数为K稳=4.08×1010,实验验证TCCa是由两个牛磺酸的氨基和磺酸基与中心钙离子结合生成的二环相连六元环状结构。采用D-Hanks平衡盐溶液模拟人体缺钙体液环境,研究解离时间、解离温度、解离pH对TCCa钙解离率的影响,测得在缺钙体液中TCCa在前2 h达到解离平衡,在人体体液环境37℃、pH=7时钙解离率达15.0±0.3%,其解离速度及钙解离率均优于L-天门冬氨酸钙(13.2±0.6%)。其次,从细胞层面探究TCCa对皮肤屏障的修复机制。在正常培养和缺钙环境下,研究TCCa对HaCaT细胞增殖分化的影响。正常培养时,TCCa在浓度为5 mM时,出现抑制细胞增殖拐点,可能促进细胞分化;TCCa在浓度为1 mM时,促进细胞增殖效果最优,此浓度下贴壁率为77.50±4.41%,克隆形成率为 9.47±4.41%,增殖活性为 116.67 ± 8.52%,TCCa处理24/48h对细胞增殖效果基本一致;与CaCl2相比,TCCa促进细胞增殖的浓度范围更广。缺钙环境下,TCCa在浓度为1 mM时,促进细胞增殖效果最优,此浓度下贴壁率为56.83±2.41%,克隆形成率为7.81±0.51%,增殖活性为149.83±4.95%,其促进作用具有时间依赖性。选取无机钙的CaC12、有机酸钙的葡萄糖酸钙(CG)和L-乳酸钙(L-CL)、氨基酸螯合钙的L-天门冬氨酸钙(L-CA)与TCCa在缺钙环境下进行对比,结果表明:TCCa组增殖活性(151.12±2.50%)高于CaC12组(106.4±4.4%);TCCa促进克隆形成的钙浓度(0.6-1.0 mM)略低于CG、L-CL(1.0-2.0mM),而经皮吸收效果优于CG、L-CL;TCCa促进细胞增殖效果及在体液中解离效果均优于L-CA。因此,与上述四种钙制剂相比,TCCa在促进细胞增殖、经皮吸收、体内解离方面具有明显优势。最后,从基因层面阐明TCCa对皮肤屏障的修复机制。采用荧光定量PCR法,测定钙离子及TCCa对HaCaT细胞皮肤屏障相关基因mRNA表达量的影响。结果表明,经过无钙处理的细胞FLG、KRT 5、KRT 10、KRT 14、JAM 1、JAM2、ZO3 的 mRNA 表达量显著降低(P 均<0.05),表明钙离子通过调控丝聚蛋白、角蛋白、紧密连接蛋白的转录表达,实现对HaCaT细胞增殖分化及修复受损皮肤屏障的作用。使用TCCa处理细胞时,浓度为1 mM的TCCa能显著上调KRT 5、KRT 14的mRNA表达量(P均<0.05),表明低浓度(1 mM)的TCCa通过调控角蛋白表达来激活基底层细胞增殖;浓度为5 mM的TCCa能显著上调KRT 1、FLG 1、FLG 2、JAM 1、ZO2的mRNA表达水平(P均<0.05),表明高浓度(5 mM)的TCCa通过调控角蛋白、丝聚蛋白、紧密连接蛋白的转录表达,促进HaCaT细胞早期分化、晚期分化及皮肤屏障的修复。与CaCl2相比,TCCa对上述基因mRNA表达量的上调比例更高,表明TCCa促进皮肤屏障修复的效果优于CaCl2。本课题研究表明TCCa具有较强稳定性,在体液中能实现良好解离,TCCa在正常培养及缺钙环境下均能促进HaCaT细胞增殖,它是通过调控角蛋白、丝聚蛋白、紧密连接蛋白的mRNA表达,实现对角质形成细胞增殖分化及皮肤屏障修复的作用,本研究为TCCa治疗皮肤屏障受损相关疾病提供理论基础和数据参考。