败血症是临床常见的危重症,尽管大量高效抗生素的不断问世和日臻完善的器官支持和重症监护技术,其病死率仍较高。所以,人们一直在研究开发有效的治疗药物。纤维连接蛋白是一种多功能的糖蛋白,能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合,参与细胞的黏附、迁移、止血、抗感染以及维持血管的完整性等作用。实验研究表明纤维连接蛋白(Fibronectin FN)具有抗败血症的作用,临床上人们应用富含Fn的冷沉淀物治疗败血症取得了较好的效果。但尚未见纯Fn制剂应用于临床败血症的报道。从血浆分离FN存在着血浆资源不足和可能传播血源性传染病的问题,同时由于FN分子量大,分子量约为450 kDa,运用基因重组的方法全分子表达又存在技术上的难题。Fn分子上存在多种功能结构域如肝素结合域、细胞结合域、纤维蛋白结合域等,FN的功能是通过这些功能结构域来实现的,因此利用基因工程技术表达FN的功能区多肽并研究其功能,以代替FN的作用不失为一种可行的方法。本课题组前期成功地用大肠杆菌表达系统表达纯化了FN的细胞结合域多肽(rhFN55多肽),实验表明rhFN55多肽具有治疗半乳糖胺敏化内毒素血症及内毒素诱导的大鼠DIC的作用;还应用基因工程方法构建了FN N端及C端的肝素结合域多肽的酵母表达载体,并筛选出了高表达的酵母表达菌株,进一步表达纯化出FNN端和C端两个肝素结合域多肽FNNHBDPP和FNCHBDPP,研究其对半乳糖胺敏化内毒素血症小鼠的作用,动物实验表明二者均具有治疗半乳糖胺敏化内毒素血症小鼠的作用。而半乳糖胺敏化内毒素血症与临床上由革兰氏阴性菌感染引起的败血症虽然在发病机制上类似,即均涉及内毒素的主导作用,但临床上革兰氏阴性菌所致的败血症除了与内毒素血症密切相关外,还与细菌本身的侵袭力有关。因此应用革兰氏阴性菌直接感染引起的败血症模型与临床败血症的发病机制更接近。为了了解这两种多肽对不同败血症模型的作用,本实验将在前期研究的基础上,进一步研究FNCHBDPP和FNNHBDPP两种多肽单用及与最大无效剂量抗菌素联用时大肠杆菌感染小鼠败血症的作用,为FNNHBDPP及FNCHBDPP的临床应用提供理论及实验依据。该研究目前在国内外尚未见报道。本文的主要研究包括以下几个部分:1两种肝素结合域多肽FNNHBDPP、FNCHBDPP制备FNNHBDPP、FNCHBDPP由本研究所自行自备的酵母表达载体中表达和制备2研究两种多肽FNNHBDPP、FNCHBDPP对大肠杆菌感染败血症小鼠的作用(1)建立大肠杆菌感染小鼠败血症模型将大肠杆菌菌株在BALB/C小鼠体内增毒,将增毒后的菌株孵育18小时后用5%高活性干酵母稀释为各种不同的菌液浓度,摸出最低致死浓度(MLD)。用5%高活性干酵母稀释至感染动物所需的终浓度,腹腔注入0.5ml1MLD菌量致小鼠感染,建立大肠杆菌感染败血症小鼠模型。(2)观察FNNHBDPP、FNCHBDPP单用以及与最大无效剂量(DMNE)的头孢曲松联用对大肠杆菌感染败血症小鼠的作用①实验分组在前期研究的基础上将FNNHBDPP分20mg/kg,40mg/kg,FNCHBDPP分40mg/kg,60mg/kg两个剂量组,对感染小鼠进行保护试验,摸索出有效剂量分别为FNNHBDPP40mg/kg、FNCHBDPP60mg/kg。同时摸索头孢曲松对该模型的DMNE为20mg/kg。在以上实验基础上将实验组分为以下各组:正常组、生理盐水对照组、单用头孢曲松组(20mg/kg)、FNNHBDPP作用组(40mg/kg 4次给药)、FNCHBDPP作用组(60mg/kg 4次给药)、FNNHBDPP联用头孢曲松组、FNCHBDPP联用头孢曲松组。②观察各组菌液注射后小鼠的状况及72小时存活率;③测定各组菌液注射后18小时血清中总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、肌酸激酶(CK)、CK同工酶的水平;④用ELISA法检测各组菌液注射后8小时血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量;⑤各组菌液注射后18小时后肝脏组织病理形态学及超微结构学的观察。取得如下结果及结论:1建立了大肠杆菌感染小鼠败血症模型;2通过观察小鼠的72小时存活率表明:生理盐水对照组小鼠的存活率仅为5%, FNNHBDPP和FNCHBDPP作用组小鼠的存活率分别为22.5%和25.3%,与生理盐水对照组比较P<0.05。FNNHBDPP联合头孢曲松组及FNCHBDPP联合头孢曲松组小鼠的存活率分别为42.7%和43.5%,经X2检验,与生理盐水对照组比较P<0.01。FNNHBDPP作用组与FNNHBDPP联合头孢曲松组之间及FNCHBDPP作用组与FNCHBDPP联合头孢曲松组之间的存活率经X2检验P<0.05。另外在多肽剂量一致的基础上比较了不同给药次数小鼠的存活率,结果发现1次给药、2次给药模型小鼠的存活率提高的不明显,而若3次给药、4次给药,FNNHBDPP治疗组的存活率为20%、22.5%,FNCHBDPP治疗组的存活率为22.7%、25.3%,3次给药、4次给药组间比较无显著性差异。3通过AST、ALT、LDH和TBIL、CK、CK-MB的测定结果表明生理盐水对照组各指标明显升高,多肽治疗组有所下降,多肽联合头孢曲松组下降的尤为明显。4通过检测血浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,表明生理盐水对照组各值明显升高,多肽治疗组有所下降,多肽联合头孢曲松组下降的更为明显。5通过病理组织和电镜学观察,表明FNNHBDPP和FNCHBDPP都能够减轻肝脏的损伤、变性、坏死。加头孢曲松的处理组呈现出更好的效应。6结论:实验表明FNNHBDPP和FNCHBDPP都具有改善大肠杆菌败血症小鼠的存活率,且若与最大无效剂量的头孢曲松联合治疗呈现出更好的效应。多肽可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的产生,减轻了炎症因子所致的生物学的效应及肝脏和其他脏器的损伤。FNNHBDPP和FNCHBDPP两种多肽对大肠杆菌败血症小鼠模型的治疗效果无统计学上的差异。