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本文以植物修复技术的模式植物-印度芥菜(Brassica juncea L.)为研究对象，对其阳离子输出(Cation-efflux，CE)转运蛋白家族基因进行了分离克隆和功能鉴定，同时对该植物响应重金属镉(Cd)胁迫差异表达的基因进行了鉴定分析。
一、印度芥菜阳离子输出转运蛋白家族基因的克隆与功能分析
利用RT-PCR和RACE技术首次从印度芥菜分离克隆了CE家族的4个全长基因，分别命名为BjCET1、BjCET2、BjCET3和BjCET4。在此工作基础上，建立了一套简单、快速、经济、有效分离克隆不同种属间同一基因家族多个新成员的PECP(a PCRenriched cDNA pooling method)新方法。
序列分析发现，BjCET1-BjCET4的ORF区核苷酸长度分别为1146 bP、1161 bp、1155 bp和1128 bp；推测编码的蛋白质分别具有382、387、385和376个氨基酸残基(aa)长度，其分子量分别为42,074、42,297、42,426和41,487道尔顿，小于目前所有已克隆的其它真核生物CE家族基因推测编码蛋白质的分子量(42,920-55,142道尔顿)，但大于来源于细菌的ZiTB和czcD基因编码蛋白的分子量(分别是34,828和33,741道尔顿)。其等电点分别为6.32、6.42、6.47和6.05，与大多数CE蛋白的等电点一样偏酸性。此外，BjCET1-bjCET4推测编码的蛋白质具有CE家族典型的拓扑结构和序列特征，包括含有1个完整的N端特征标签序列、1个C端阳离子输出域和6个跨膜结构域(TM1-6)，并且在TM4和TM5之间含有一个位于胞质内的富His结构域。种系发生树分析发现具有典型CE家族成员特征的氨基酸序列可以作为一个比较准确的种属分类依据。N端序列“TDAAHLLSDVAAFAISLF”以及富His胞质环中的“SH(GD)VT(VD)TTH”序列可以作为印度芥菜，乃至其它植物该类CE家族蛋白的标志性序列。
通过转化细菌、酵母和烟草研究了BjCET1-BjCET4转运蛋白基因的功能特性。构建了细菌表达载体pASK-IBA3-BjCETx(1-4)和酵母表达载体PYES2-BjCETx(1-4)，并获得四个基因的重金属敏感型细菌(GG48)和酵母(YK40，K41&YK44)的转化菌株。重金属抗性分析发现，BjCET1-BjCET4的表达能够不同程度提高转化菌的耐Cd、Zn、Ni、Co重金属能力，其中BjCET1和BjCET4在细菌中的抗Cd能力较为显著，BjCET1和BjCET2在酵母中的抗Zn、Co能力比较突出。
将BjCET1-BjCET4基因分别克隆入pBIN-mGFP5-ER载体，构建了与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合表达的植物表达载体，经农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了四种基因的烟草W38转基因植株，激光共聚焦显微镜观察到四种转基因烟草的根部和叶部均有荧光存在。对转基因植株的重金属抗性与富集量分析发现，过量表达BjCET1-BjCET4基因能够显著提高烟草叶片愈伤组织在Cd胁迫条件下的分化、再生能力，以及根的再生能力和抗Cd胁迫能力，其中以BjCT4基因的表现最为突出。目前还未见类似报道。GFP亚细胞定位显示BjCET1和BjCET3在根部主要位于细胞质膜上，推测通过向细胞外输出Cd2+提高了根的抗Cd能力； BjCET2和BjCET4可能是通过Cd2+的细胞内隔离(如液泡)提高了根的抗Cd能力。BjCET4转基因烟草最具有植物修复Cd污染土壤的潜力，BjCET2基因有望在降低污染重金属在粮食或蔬菜可食部位的积累方面发挥作用。
二、印度芥菜镉胁迫响应基因的克隆与初步分析
应用mRNA荧光标记差异显示技术从印度芥菜的根部和叶部共分离出154条Cd响应差异表达的cDNA条带。Northern印迹和反Northern印迹杂交实验结果显示，所分析上调表达cDNA条带中的28条(叶部15条，根部13条)在Cd胁迫条件下大都有2-5倍的mRNA转录增量。
通过NCBI-BLAST软件与GenBank数据库中的基因序列比较分析发现，28个上调表达基因可以归类为23个不同的基因家族，包括激素响应蛋白GH3、APS还原酶、Ras、过氧化氢酶、ARD/ARD、Nop、转位酶22、C3HC4型锌指蛋白、甘油二酯激酶、GAPDH等家族，以及RAMP4膜蛋白(KOG3491)。有7个cDNA克隆与GenBank数据库中的序列未表现出有意义的同源性。许多上调基因与GenBank数据库中与病菌感染、脱水、冷、高盐、ABA、热和紫外线等生物或非生物胁迫相关的基因表现了很高的氨基酸序列一致性，表明Cd胁迫对基因的表达具有多型效应。同时预示Cd胁迫信号与其它生物或非生物胁迫信号之间存在着交叉对话或同一的信号途径。过氧化氢酶CAT3基因的过量表达预示高的抗氧化能力可能是印度芥菜富集Cd的重要机制之一。
此外，我们还获得Ras大家族中的类似ARF的小GTP酶/ARF ADP-核糖磷酸化因子亚家族基因(克隆DD7)和ARD/ARD家族基因(克隆DD10)的全长cDNA序列。目前对二者在印度芥菜中响应Cd以及其它一些重金属元素胁迫条件下所发挥的作用正在做进一步深入研究。