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1.果蝇ECPW2克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析
真核生物翻译过程中需要许多蛋白质因子的参与和调节。果蝇蛋白ECP是一种含有翻译起始因子eIF5C结构域的蛋白质，含有422个氨基酸残基，两个独立折叠的结构域:N端结构域属于经典亮氨酸拉链家族;C端结构域属于含有W2结构域的BZW家族。同源序列比对后，我们发现ECP的W2结构域与许多真核翻译起始因子序列有着较高的序列同源性。同源性较高的有:人源eIF2Bepsilon亚基C端结构域，人源P97C端结构域，eIF4gamma亚基和eIF5。跟据文献报道，ECP可以与酿酒酵母中核糖体相关蛋白dRPL5发生免疫共沉淀，且突变体有着相似的缺失表型。因此我们推测ECP参与了蛋白质的转录起始过程。ECPW2结构域的晶体结构有助于我们了解ECP在细胞内如何行使功能。我们从含有果蝇ECPcDNA的质粒中克隆了ECPW2结构域的CDS序列，构建了ECPW2-p28质粒，并将EcpW2-p28质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，经过IPTG诱导，重组蛋白ECPW2在E.coliBL21(DE3)可溶性表达，用Ni亲和柱进行初步纯化。随后对于Ni柱纯化的洗脱液进行浓缩、脱盐以及换盐等一系列条件摸索，发现蛋白在buffer25mMTris-HCl，pH8.0，NaCl盐浓度大于40mM/L的条件下，蛋白质溶液可以稳定存在。通过阴离子交换层析纯化和Superdex200凝胶阻滞层析纯化，我们得到了高纯度的ECPW2蛋白。用悬滴气相扩散法经过初筛和梯度优化以及Addtive晶体优化条件摸索，我们得到了可以用做X-RAY衍射的ECPW2蛋白结晶体。X-Ray衍射数据分析表明晶体衍射分辨率可达到2.70(A)，完成了晶体衍射数据的收集，晶体空间群为I4，晶胞参数为a=b=81.05，c=57.44(A)。一个晶体学不对称单位有一个蛋白质分子。ECPW2与人源翻译起始因子eIF2epsilon亚基有24％的同源性，以人源翻译起始因子eIF2BesilonsubunitC端结构域为结构模型，用Molrep程序运行分子置换求解相位但没有得到合适的解。我们考虑进一步进行硒代蛋白的纯化。目前已经可以得到纯度较高硒代蛋白，蛋白的晶体生长条件仍然在摸索中。
2.E.ColiDnaB、DnaC克隆、表达、纯化和结构探究
E.coli中，DnaB是最主要的负责解旋双链DNA(dsDNA)的酶之一，在复制起始阶段DnaB将双链DNA解旋成单链DNA(ssDNA)。在经典模型中，DnaA结合在OriC附近一段被称作TATA盒的序列，TATA盒会自发轻度解旋。随后DnaA招募了DnaB，在DnaC的协助下，DnaB结合到OriC上，伴随着结合的发生ATP水解DnaC解离。DnaB发挥5’→3的解旋酶活性，将双链DNA解旋为单链，以便其余蛋白质装配。DNA的复制发生在解旋过后由各种蛋白质分子装配的复制叉中，而且DnaB必须在DnaC、ATP以及Mg2+的存在下才可以与OriC结合。
DnaB有471个氨基酸残基，它的分子量约为52.4kDa，其中N端30位氨基酸到127位氨基酸序列的核磁结构已知。DnaC有255个氨基酸残基，它的分子量约为27.9kDa。关于DnaB与Dna1C结合的结构学信息仍然很少，通过了解DnaB、DnaC的结构信息，有助于进一步研究在复制的过程中，DnaB和DnaC是怎样进行装配的。
我们构建了以下这些质粒:DnaB-p28质粒、DnaC-pET22b质粒、DnaC-p28质粒。将DnaB-p28质粒以及DnaC-p28质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)，加入IPTG诱导后重组蛋白His6-DnaB和His6-DnaC都可以可溶性的表达。重组蛋白DnaB和DnaC分别用Ni亲和柱进行初步的纯化，洗脱液在浓缩脱盐时发生了蛋白质变性沉淀。在缓冲溶液中加入Mg2+和ATP，沉淀现象得到了改善，经过疏水层析以及凝胶阻滞层析(Superdex200)得到了纯度较高的蛋白，通过洗脱体积与预测的分子量比较，推测DnaB与DnaC在蛋白溶液中均是以单体形式存在。经过实验室机器人晶体初筛，对有晶体的生长条件进行了梯度优化，但是均没有发现晶体。目前DnaB，DnaC的晶体生长条件仍在摸索中。
我们将DnaB-p28质粒，DnaC-pET22b质粒共转染BL21(DE3)，希望DnaB和DnaC在细胞内共表达，以获得大分子蛋白质的复合物。DnaB，DnaC在E.coliBL21(DE3)中共同表达，同时在bindingbuffer中添加了ATP和Mg2+，经过过Ni亲和柱纯化后，在洗脱液中发生了剧烈的沉淀，得到的可溶性蛋白很少，目前纯化的条件仍然在摸索中。