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核基质附着区（matrix attachment regions，MARs）又被称作核骨架附着区（scaffold attachment regions，SARs），是染色质被限制性酶消化后仍然结合在核基质上的DNA序列。目前还没有发现MARs序列具有保守的一致序列，但是它们之间具有一些共有模体，如：A-box、T-box、酵母自主复制序列、果蝇拓扑异构酶Ⅱ识别位点、弯曲DNA等。近年来的研究发现，MARs能够提高外源基因表达，降低转基因沉默，同时还能使染色质形成环状结构，也可以作为DNA复制的起始点或者调控基因的转录，目前关于MARs的调控机制仍然不清楚。真核生物基因的表达调控主要是顺式作用DNA元件与反式作用蛋白因子的相互作用实现的，因此要研究某一顺式作用元件的调控机制，必须首先分离与其相互作用的反式作用蛋白因子并研究其功能。能有与MARs序列相结合的蛋白被称作MAR结合蛋白（MAR-binding proteins，MARBPs），目前，已经有少量MAR相关的蛋白被克隆出来，但是尚未见到有关单细胞藻类杜氏盐藻MAR结合蛋白的报道。杜氏盐藻（Dunalilla salina）是一种简单的单细胞真核绿藻，没有细胞壁，是一种抗逆性极强的生物，能在NaCl浓度为0.05～5M的培养液中生存。杜氏盐藻为单细胞藻类，没有组织和器官上的特异分化，因此以它为研究材料来研究MARs调控机制有独特的优势。前期工作中，我们构建了杜氏盐藻MAR序列文库，分离出了3个强MAR序列，克隆出一个MAR结合蛋白基因，基因全长1623bp，编码541个氨基酸（GenBank accession no：DQ=1124215，AAZ31075）。为研究MAR结合蛋白的相关功能，本研究根据GenBank上登录的序列设计特异引物，克隆杜氏盐藻MARBP基因全长，构建原核表达载体，转入大肠杆菌工程菌BL21（DE3）中表达MARs序列结合蛋白，最后利用凝胶滞留试验体外验证它和MARs序列的结合能力。这将为进一步探讨其在体内的生物功能提供可靠的实验依据，同时为研究MARs调控机制奠定基础。一、杜氏盐藻MARBP基因的克隆及序列分析1方法1．1杜氏盐藻总RNA的提取采用TRIzol试剂从生长至对数期的杜氏盐藻细胞中提取盐藻总RNA。1．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析根据GenBank上登录的MARBP的cDNA全长设计引物。以杜氏盐藻总RNA为模板，用AMV反转录酶合成cDNA第一链，并以合成的cDNA第一链为模板进行PCR扩增杜氏盐藻MARBP基因的序列全长。PCR产物连接T载体上，测序。测序正确的质粒命名为pMD-MBP。测序结果与GenBank上的MARBP基因序列进行比对分析，并BLAST进行同源性分析。2结果2．1杜氏盐藻总RNA的制备提取的总RNA OD260/OD280在1.8-2.0之间，OD260/OD230大于2.0，说明纯度较高；1％琼脂糖电泳可见28s和18s两条清晰的rRNA条带，且18s与28s rRNA荧光强度比值约为1：2，表明RNA保持较好的分子完整性。2．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析测序分析表明，所克隆序列长1623 bp，编码541个氨基酸；BLAST结果显示，该序列与GenBank上登录的杜氏盐藻MARBP的cDNA序列具有99％的同源性，而所编码氨基酸序列之间存在一个氨基酸残基的差异。表明所克隆的序列确实是杜氏盐藻MARBP基因的cDNA序列。二、杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体的构建及表达1方法1．1杜氏盐藻原核表达载体的构建EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切质粒pMD-MBP，胶回收并纯化MARBP cDNA片段，同样对pET-28a（+）载体进行EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切，纯化回收线性载体片段后，用T4DNA连接酶连接目的基因片段和线状载体，构建杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体pET-MBP。载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，小量提取质粒，用EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切鉴定，测序确定读码框是否正确。1．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达将经鉴定读码框正确的重组原核表达载体pET-MBP转化大肠杆菌工程菌株BL21，挑选阳性菌落，接种到5mL卡那霉素浓度为50mg/L的LB培养基中，37℃振荡培养12h，按照1：100的比例接种到新的卡那霉素浓度为50mg/L的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.4-0.6之间，加入IPTG使其终浓度为0.2 mM，继续培养并分别于1，2，4，6，8 h，离心收集菌体1 ml，加入100μl 1×凝胶上样缓冲液，100℃水浴煮沸3 min，10％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况。1．3 Western blotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达pET28a（+）原核表达系统产生的融合蛋白，其N端均携带6×组氨酸标签（6×His tag），利用抗6×his tag抗体（北京普利莱基因技术有限公司）为一抗和山羊抗小鼠IgG （北京中山生物技术有限公司）为二抗，对表达的重组蛋白进行Western blotting分析，检测重组蛋白在BL21中表达情况。2结果2．1杜氏盐藻原核表达载体的构建将杜氏盐藻MARs序列结合蛋白定向克隆于原核表达载体pET28a（+）中，双酶切鉴定以及序列测定结果表明，基因插入方向正确，没有发生读码框易位，原核表达载体pET-MBP构建成功。2．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达pET-MBP转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组融合蛋白表达，SDA-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效的表达，融合蛋白分子量大小约为75KD。2．3 Western blotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达用6×抗his tag的抗体作为一抗，用山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗做Western blotting分析。结果显示在75KD处有特异条带，证明含有6×his tag的融合蛋白已经表达。三、杜氏盐藻MARs结合蛋白的纯化及功能分析1方法1．1重组蛋白的纯化离心收集经IPTG诱导培养的细菌，用蛋白纯化试剂盒中的结合缓冲液重悬菌体，高压细胞破碎仪破碎细胞，1.5×105 kPa的压力条件下持续1h。之后10000rpm离心15min分离上清和沉淀。按照试剂盒说明书操作纯化蛋白。1．2生物素3′末端标记探针用生物素3′末端标记试剂盒（PIERCE），标记已分离的MARs序列和由上海生工合成的DNA序列，作为探针，并检测探针标记效率。1．3凝胶滞留试验（Electrophoretic Mobility Shift Assays，EMSA）凝胶滞留试验可以检测DNA与其特异性结合蛋白相结合状态。利用以上步骤的纯化后的融合蛋白和标记好的探针，使蛋白质和DNA发生特异性结合，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，检测其迁移率的变化。2结果2．1重组蛋白的纯化重组蛋白经Ni-NTA spin column亲和层析柱纯化之后，用Strip Buffer洗脱之后可以得到较高纯度的蛋白，电泳结果显示，纯化后蛋白约占总蛋白含量的70％。2．4生物素3′末端标记探针探针标记效率良好，可供以下试验使用。2．5凝胶滞留试验凝胶滞留试验结果表明，在大肠杆菌BL21中表达的杜氏盐藻MARs序列结合蛋白并不能与标记的探针发生特异性的结合。四、结论1．本研究成功克隆了杜氏盐藻MARs序列结合蛋白基因cDNA序列编码区，全长为1623 bp，编码541个氨基酸。通过BLAST分析可知，该基因与GenBank上登录的序列具有99％的同源性，与其他物种的MARs序列结合蛋白也具有较高的同源性。2．构建了杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功表达外源融合蛋白质，融合蛋白大小约为75 KD。