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Kupffer细胞是肝脏中所占比例最高的免疫细胞,它可以作为抗原呈递细胞参与肿瘤监测以及肝脏的再生过程,在先天免疫反应和宿主防御中发挥着重要作用。越来越多的证据表明kupffer与内毒素（LPS）的相互作用可能引发各种类型的肝损伤包括内毒素血症、酒精性肝损伤和缺血再灌注损伤以及系统性的病毒感染。然而目前多关注炎症后对代谢变化的影响,关于代谢关键酶在免疫激活中的作用研究甚少。尽管近几年研究发现,PCK2除了作为糖异生关键酶,它在肥胖,肿瘤等疾病以及单核细胞和免疫细胞中也能够高峰度表达。然而,关于PCK2与炎症免疫激活的关系目前还未见报道。RNA m6A甲基化修饰是目前己知的RNA中唯一一个可逆的修饰,其在mRNA剪接,降解和翻译中起关键作用。然而目前,关于m6A与炎症的关系及PCK2是否参与m6A的调控还不清楚。因此,本文在小鼠及Kupffer细胞系上建立炎症模型,研究PCK2对炎症免疫激活的影响及其作用机制。1 LPS诱导的肝脏免疫激活与PCK2表达变化12 只 6 周龄 ICR（Institute of Cancer Research）雄性小鼠按体重 20.6±0.1（Mean±SD）随机分为对照组（Con,n=6）和LPS组（LPS,n=6）。LPS组静脉注射5mg/kg LPS,对照组注射等体积的生理盐水。LPS注射后2 h,肝脏TLR2（Toll-like recepter）的mRNA的表达极显著升高（p<0.01）;TLR4的mRNA的表达未受到影响;肝脏中促炎细胞因子白介素 IL（interleukin）-6、IL-lβ、IL-12b、趋化因子 MCP1（monocyte chemoattractant protein 1）以及抗炎细胞因子IL-10的基因表达均极显著升高（P<0.01）。LPS注射后2 h血液中谷草转氨酶AST（Aspartate transaminase）、谷丙转氣酶ALT（glutamic-pyruvic transaminase）有升高的趋势（0.05<P<0.1）、葡萄糖 GLU（glucose）极显著下降（P<0.01）、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C（high-density lipoproteincholesterol）显著升高（P<0.05）、低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C（low-density lipoproteincholesterol）显著下降（P<0.05）、总胆固醇 CHOL（cholesterol）和甘油三酯TG（triglyceride）没有显著变化（P>0.05）、乳酸盐脱氢酶LDH（lactate dehydrogenase）极显著升高（P<0.01）。促炎细胞因子IL-6、IL-12P70、肿瘤坏死因子 TNFα（tumornecrosis factor）、干扰素 IFNy（interferon-γ）;趋化因子 MCP1,抗炎因子IL-10均极显著升高（P<0.01）。HE染色显示肝脏肝索不清晰,细胞肿胀,糖原染色显示,糖原在LPS处理后急速消耗。此外,免疫组化染色结果显示,LPS处理后肝脏Kupffer细胞免疫激活,F4/80,CD68表达量增加。我们进一步对肝脏糖异生关键蛋白进行检测。结果发现PCK1,PCK2蛋白表达在肝脏中极显著下降（P<0.01）。免疫荧光结果显示,肝脏PCK2在肝细胞中表达下降,而在kupffer细胞中表达升高。使用1μg/mL LPS处理kupffer细胞12 h,24 h后细胞因子mRNA表达极显著升高（P<0.01）,检测细胞上清中分泌的细胞因子也同时显著升高（P<0.05,P<0.01）。使用1μg/mL LPS处理kupffer 12 h后TLR2 mRNA表达显著升高（P<0.05）,但TLR4极显著下降（P<0.01）。使用1μg/mL LPS处理kupffer 12 h后TLR2的蛋白表达显著升高（P<0.05）,NFκB（p65）转位入核,胞浆及胞核p65均显著升高（P<0.05,P<0.01）,但TLR4没有变化;线粒体膜电位极显著下降（P<0.01）;线粒体自编码基因均显著下调（P<0.05）;PCK2表达总蛋白显著升高（P<0.05）,但mRNA表达无显著差异;分析其亚细胞分布发现,在LPS处理后PCK2主要在胞浆中分布,并显著升高,而线粒体中分布减少,胞核几乎无表达。本章结果预示,PCK2存在亚细胞分布特异性和细胞特异性,与炎症免疫激活相关。2 PCK2在炎症反应过程中的作用及其机制为了研究PCK2如何参与炎症调控,我们分别使用2 mM、3 mM、4 mM 3MP（PCK2抑制剂）处理免疫激活的Kuppfer细胞。结果显示,不同浓度3MP处理后PCK2的酶活极显著下降,4 mM时作用最强（P<0.01）。进一步检测炎症标志物mRNA表达,结果表明,IL-6、IL-1β、Cc12、IL-10均极显著下调,4mM时下调最显著（P<0.01）。同时检测细胞上清中分泌的细胞因子包括IL-6、MCP1和IL-10。结果显示不同浓度3MP处理后其含量均极显著下降（P<0.01）shRNA敲低PCK2的表达后,炎症标志物IL-6、IL-10 mRNA表达极显著下调（P<0.01）,细胞上清中分泌的细胞因子IL-6、IL-10极显著下降（P<0.01）。我们选取4 mM 3MP处理Kupffer细胞12 h后,结果发现,NFκB信号通路被抑制,IKKα、p-p65蛋白表达极显著下降（P<0.01）,p65总蛋白极显著升高（P<0.01）,p-p65/p65其比值极显著下降（P<0.01）,琥珀酸含量及ROS含量显著下降（P<0.01）,HIF1α、NLRP3、Caspase1、p-AKT、p-p38、p-ERK 均极显著下降（P<0.01）。使用siRNA干扰PCK2表达后,炎症信号通路关键蛋白p-ERK、p-AKT表达下降,使用AKT抑制剂MK2206后发现炎症通路关键蛋白p-AKT、p-GSK3β、IKKα均下降,而PCK2表达不受影响。进一步使用Phos-tag SDS-PAGE方法检测出PCK2存在蛋白磷酸化。使用siRNA和3MP分别抑制PCK2后,结果发现总的丝氨酸磷酸蛋白在分子量35kDa-72kDa范围内的蛋白水平下降,通过Co-IP证实ERK、AKT磷酸化均受到PCK2的影响。以上结果表明,PCK2可能通过抑制AKT/MAPK信号通路的磷酸化水平进而促进NFκB的信号转导,从而参与炎症免疫激活。3 LPS诱导的Kupffer细胞m6A变化我们通过Slot blot检测m6A总体水平。结果发现,LPS处理枯否氏细胞12 h后,其m6A总体水平极显著升高（P<0.01）。进一步利用western blot检测m6A去甲基化酶,腺苷甲基转移酶及阅读蛋白的表达。结果发现LPS处理12 h后,去甲基化酶FTO表达显著下降（P<0.01）,而腺苷转移酶Mett13,Mettl14,WTAP;阅读蛋白YTHDF2均显著升高（PO<0.01）。使用的MeRIP-seq方法,对Kupffer细胞LPS处理/未处理的整个mRNA甲基化进行测序。从总共7641个推定的甲基化位点,我们确认了 m6A的共识序列GGAC作为基序。同时发现,m6A位点的分布也发生变化,3’UTR所占比例从13.95%升高到34.18%;5’UTR所占比例从0.96%升高到4.77%;exon所占比例从44.19%升高到56.18%。对目的基因进行生物学通路富集分析,结果表明,炎症信号通路的相关目的基因m6A水平发生显著变化。尽管PCK2的mRNA m6A水平并没有变化,但TLR2及其下游Traf6mRNA m6A分别在5’UTR,Exon发生显著变化。腺苷甲基转移酶Mett13 siRNA干扰后炎症相关基因TLR2、IL-1β、IL-10基因表达均显著缓解,但对PCK2没有显著影响,同时Mettl3干扰后TLR2蛋白表达下降。3MP抑制PCK2后,Kupffer细胞m6A总体水平显著下降,干扰PCK2表达后显著抑制Kupffer细胞Mett13的表达,同样3MP处理后,m6A相关蛋白表达均得到缓解。以上结果表明,LPS诱导的Kupffer细胞免疫激活,导致其总体mRNA的m6A显著升高,m6A的变化有助于炎症的发生。同时PCK2可能听过影响m6A影响炎症发生。综上所述,LPS诱导的肝脏炎症引起PCK2的表达的细胞特异性和亚细胞分布特异性,即在肝细胞中表达下降,Kupffer细胞中表达升高,并在Kupffer细胞胞浆中表达升高而不是线粒体。PCK2在胞浆的表达升高,一方面,促进了炎症信号通路的关键蛋白AKT/MAPK的磷酸从而促进炎症的激活。另一方面,可能通过影响m6A的变化影响炎症激活。m6A在炎症激活过程中升高,但主要集中在炎症信号通路,并不影响代谢通路尤其是PCK2。