论文部分内容阅读
[背景]膀胱癌（bladder cancer,BC）的发生是一个多步骤、多阶段、多因素参与的复杂生物学过程。根据2012年的一项全球肿瘤发表率的多中心统计,BC是世界上第九位最常见的癌症,每年估计有43万新增病例;而每年全球共有16.5万人死于BC,其中男人BC死亡人数占到了总死亡人数的75%。BC复发率高、易浸润转移的特性一直是临床上治疗BC及提高生存率的主要难点。诸多研究证明,实体肿瘤的发生、发展得益于其生存的肿瘤微环境,其内不仅含有肿瘤细胞,而且含有浸润肿瘤的免疫细胞,其中,巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要免疫细胞之一。肿瘤微环境中巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）,通常指的是对肿瘤生长有促进作用的M2型,即M2 TAM细胞;M2 TAM细胞通过分泌相关因子促进肿瘤的生长。IL-6是肿瘤细胞及巨噬细胞均会分泌的细胞因子,其不仅可以促进肿瘤细胞的生长,还可以诱导巨噬细胞由M1型向M2型极性转化。microRNA（miRNA）是一类长度为21-25寡核普酸组成的单链小分子非编码RNA,通过结合靶基因的3’ UTR端,可以抑制靶基因翻译成蛋白或直接促使其被RNA酶降解。miRNA的这种在转录后水平调控基因表达,广泛参与了肿瘤的生长与调控肿瘤的免疫。其中miR-26b-5p在包括BC在内的多种肿瘤细胞低表达,并起到一个抑癌基因的作用,但其具体作用机制还尚不清楚。近期表观遗传调控基因表达越来越引起研究的重视,其中EZH2催化的组蛋白H3的第27个氨基酸上三甲基化（trimethylation of lysine 27 on histone 3,H3K27me3）调节染色质结构紧密性,进而沉默抑癌基因或miRNA的表达,可以揭示肿瘤中部分抑癌miRNA处于低表达原因,但其具体的调控机制还有待进一步阐明。因此,本项目通过实验和生物信息学数据,探索miR-26b-IL-6-EZH2-TAM间的交互反馈回路促进BC免疫抑制的进程和机制,期望揭示BC进展的部分微观机制。[目的]（1）阐明膀胱癌细胞miR-26b-5p-IL-6-EZH2对膀胱癌细胞和TAM细胞免疫应答的影响和机制。（2）阐明TAM细胞通过IL-6/STAT3/EZH2通路表观遗传调控miR-26b-5p促进膀胱癌发生发展的机制。（3）构建膀胱癌微环境中,IL-6及EZH2与miR-26b-5p通过交互负反馈诱导膀胱癌与TAM细胞共生协同关系的分子模型。[方法]:（1）miR-26b-5p对膀胱癌增殖、侵袭行为和THP-1（TAM）的功能的影响①采用RT-qPCR检测miR-26b-5p在膀胱癌样本及细胞系中的表达水平,并通过免疫组化及原位杂交验证miR-26b-5p与IL-6及EZH2基因在膀胱癌组织样本中的表达;②通过CCK8、克隆形成实验、Transwell实验检测miR-26b-5p的表达对T24的增殖、迁移、侵袭的影响;③ELISA检测T24细胞miR-26b-5p的表达对THP-1（TAM）的IL-6、IL-10因子分泌的影响;④共培养下,PCR检测T24细胞miR-26b-5p的表达对THP-1（TAM）极性分化的影响,通过荧光微球吞噬实验检测THP-1（TAM）吞噬作用。（2）miR-26b-5p通过靶向调节IL-6及EZH2抑制T24增殖、迁移及侵袭作用①生物信息学预测miR-26b-5p的靶基因;②RT-qPCR、Western Blot（WB）检测mi R-26b-5p的表达对IL-6及EZH2的mRNA及蛋白的表达的影响;③通过荧光素酶实验验证miR-26b-5p是否可以靶向结合IL-6、EZH2 mRNA的3’ UTR;④采用CCK-8增殖、Transwell实验,检测IL-6对T24细胞增殖、迁移、侵袭作用的影响;⑤功能挽救实验验证miR-26b-5p靶向IL-6调节T24生物学行为。（3）膀胱癌T24细胞分泌IL-6对THP-1（TAM）功能影响的机制研究①CCK8实验检测T24细胞IL-6对巨噬细胞增殖的影响;②PCR检测T24细胞IL-6的表达对THP-1（TAM）极化的影响;并通过荧光微球吞噬实验检测THP 1（TAM）的吞噬功能;③WB实验检测T24细胞分泌IL-6对巨噬细胞IL-6/STAT3信号通路的影响。（4）M2 TAM细胞IL-6反馈调控膀胱癌miR-26b-5p表达的机制研究①Transwell实验证明M2 TAM分泌IL6对T24细胞侵袭,转移能力的影响;②RT-PCR及WB检测共培养中膀胱癌细胞相关通路基因（IL6、STAT3、pSTAT3、EZH2）和miR-26b-5p表达;并进一步验证EZH2是否催化miR-26b启动子的H3K27me3,抑制miR-26b-5p表达;③5’ RACE的方法确定miR-26b的转录起始位点（TSS）,CHIP-PCR分析EZH2催化的H3K27me3调控在miR-26b启动子具体范围。[结果]:（1）miR-26b-5p在膀胱癌细胞系及膀胱癌组织中低表达,与IL-6及EZH2的表达呈负相关,同时三者与膀胱癌分级呈现关联可能。T24细胞miR-26b-5p的表达可以抑制T24细胞的增殖、迁移、侵袭能力,降低THP-1（TAM）的IL-6、IL-10因子分泌,上调 THP-1（TAM）的 IL-12、IL-1B、TNF-a 基因表达,下调 IL-1RA、IL-6、IL-10、IL-4、CCL17基因表达;并通过抑制THP-1（TAM）向M2型极性转化,进而促进其吞噬功能。（2）TargetScan、PicTa 及 miRanda 预测到 EZH2 及 IL-6 均为 miR-26b-5p 的靶基因;miR-26b-5p通过结合IL-6及EZH2 mRNA的3’ UTR下调其表达;进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力。（3）T24细胞的IL-6表达可以增强THP-1（TAM）增殖能力,激活THP-1（TAM）的IL-6/STAT3来诱导THP-1（TAM）M2型极性转化,并抑制THP-1（TAM）对荧光微球的吞噬作用。（4）M2 TAM细胞分泌IL6可以增强T24细胞侵袭,转移作用;其主要是通过激活IL-6/STAT3/EZH2通路,由EZH2的表达增加miR-26b核心启动子区域H3K27me3甲基化程度,最终表观遗传沉默pre-miR-26b的转录,下调miR-26b-5p表达。[结论]（1）BC中的miR-26b-5p通过靶向抑制IL-6的表达;影响TAM内的IL-6/STST3信号通路激活,参与到TAM免疫功能调节。（2）BC中EZH2通过介导H3K27me3组蛋白甲基化修饰,抑制miR-26b-5p表达,展现了新的转录调控网络模式。（3）原创性提出科学假设解释膀胱癌免疫抑制的机制,即BC与M2 TAM通过miR-26b-5p-IL-6-EZH2-TAM交互负反馈回路形成两者协同的肿瘤微环境,促进BC不可控制性生长和TAM细胞免疫抑制,从而导致BC进展。