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背景卵巢癌(Ovarian cancer)是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,早期病变不易发现,晚期病例缺乏有效的治疗手段,因此卵巢癌致死率居妇科恶性肿瘤首位。手术是治疗卵巢上皮性癌的主要手段,但基于卵巢癌易于盆腹腔内广泛转移的特点,即使外观上肿瘤局限在原发部位,也可存在广泛微转移,因此术后常常须辅以化学药物治疗。然而,化疗药物的非选择性细胞毒作用,不仅引起药物的损失及严重的副反应,还降低化疗药的肿瘤生物治疗效应,并最终衍变为化疗耐药而死亡。因此,寻找新的、特异性强且高效的治疗卵巢癌的有效方法对于提高卵巢癌患者的生存率刻不容缓。近年来,靶向治疗已逐渐成为卵巢癌治疗的新策略。卵巢癌靶向治疗目前虽然在动物实验和临床前实验中取得了一定进展,但仍存在很多问题,其中亟待解决的主要难题是靶向性差和载体转导效率低等。针对卵巢癌靶向治疗中的瓶颈,本项目在我们前期研究的基础上,将具有良好靶向性的卵巢癌特异性结合肽OSBP-1、具有跨膜转导功能的细胞穿膜肽TAT以及具有诱导肿瘤细胞凋亡的MKK6(E)三者有机结合,构建TAT-OSBP-1-MKK6(E)重组融合蛋白卵巢癌靶向输送治疗系统,并通过体内外试验评估该系统的靶向输入能力及抗肿瘤作用,为卵巢癌治疗探索新的有效途径。方法体外实验：1.构建pGEX-6P-3/TAT-OSBP-1-MKK6(E)、pGEX-6P-3/TAT-OSBP-1、 pGEX-6P-3/TAT-MKK6(E)及pGEX-6P-3/MKK6(E)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行GST融合蛋白的诱导表达和纯化,纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting分析无误后,进行GST融合蛋白的酶切,获得目的蛋白,进行目的蛋白N端的FITC和生物素标记。2.细胞免疫荧光鉴定FITC标记的TAT-OSBP-1-MKK6(E), TAT-MKK6(E)和MKK6(E)对卵巢癌H08910细胞的靶向穿膜能力,正常卵巢上皮(OSE)细胞作为阴性对照细胞。3.CCK-8法检测TAT-OSBP-1-MKK6(E)对卵巢癌H08910细胞的增殖抑制作用(TAT-OSBP-1作为阴性对照),OSE细胞作为阴性对照细胞。4.流式细胞术检测TAT-OSBP-1-MKK6(E)对卵巢癌H08910细胞的转染效率和凋亡率(TAT-OSBP-1作为阴性对照,PBS作为空白对照),OSE细胞作为阴性对照细胞。体内实验：1.采用细胞接种法将卵巢癌H08910细胞接种至18只SPF级雌性BALB/C裸鼠右前肢腋下皮肤下建立裸鼠皮下移植瘤模型。模型建立成功后将裸鼠随机分成三组,即TAT-OSBP-1-MKK6(E)、TAT-OSBP-1(阴性对照)和生理盐水(空白对照)组,每4天(第1、5、9、13、17天)经尾静脉给与不同干预。治疗期间每2日测量各组裸鼠移植瘤直径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。治疗第21天经尾静脉注射生物素标记的TAT-OSBP-1-MKK6(E),TAT-OSBP-1或生理盐水,2h后处死各组裸鼠,摘取移植瘤称重并摘取卵巢和肝脏用于后续实验。2.应用苏木素-伊红染色(HE染色),光学显微镜下观察各组裸鼠移植瘤的病理形态学特征。3.免疫组化检测生物素标记的TAT-OSBP-1-MKK6(E)在裸鼠移植瘤、卵巢及肝脏组织的分布。4.TUNEL法检测TAT-OSBP-1-MKK6(E)组卵巢癌移植瘤、卵巢及肝脏组织的凋亡情况。结果体外实验：1.获得目的蛋白TAT-OSBP-1-MKK6(E)、TAT-OSBP-1、TAT-MKK6(E)、和MKK6(E),另外,目的蛋白经FITC和生物素标记后纯度均大于95%。2.免疫荧光实验表明,TAT-OSBP-1-MKK6(E)能靶向进入卵巢癌H08910细胞,而不是OSE细胞,TAT-MKK6(E)能跨膜进入上述两种细胞,但缺乏细胞选择性,而MKK6(E)不能进入上述两种细胞。3.CCK-8试验表明,TAT-OSBP-1-MKK6(E)处理组H08910细胞存活率为(32.05±2.45%),明显低于OSE细胞(95.69±0.7%)及TAT-OSBP-1阴性对照组[分别为(95.16±0.93)%和(93.05±0.46)%),差异均具有统计学意义(**P均<0.01),其余各组差异均无统计学意义(P均>0.05)。4.流式细胞术结果显示,与TAT-OSBP-1组类似,TAT-OSBP-1-MKK6(E)组H08910细胞的平均荧光强度MFI(95.1±2.2)明显大于OSE细胞(38.1±1.1),差异有统计学意义(**P<0.01)。TAT-OSBP-1-MKK6(E)组H08910细胞凋亡率为32.55%,明显高于OSE细胞(凋亡率4.87%)、TAT-OSBP-1阴性对照组(分别为6.65%和6.73%)和PBS空白对照组(分别为6.47%和4.32%),差异均有统计学意义(**P均<0.01),而其余各组细胞的凋亡率接近,差异均无统计学意义(P均>0.05)。体内实验：1.从治疗第9天起,TAT-OSBP-1-MKK6(E)组裸鼠移植瘤的生长速度滞后于TAT-OSBP-1阴性对照组和NS空白对照组,差异均有统计学意义(*P均<0.05),而TAT-OSBP-1组与NS组差异均无统计学意义(P均>0.05)。TAT-OSBP-1-MKK6(E)组平均瘤重为(0.28±0.11)g,明显低于TAT-OSBP-1组(0.6±0.18)g和NS组(0.67±0.18)g,差异均有统计学意义(**P均<0.01),而TAT-OSBP-1组与NS组差异无统计学意义(P>0.05)。2.3组裸鼠移植瘤组织的HE染色结果显示,TAT-OSBP-1-MKK6(E)组肿瘤组织内细胞核固缩多见,并见大片坏死区域,坏死区域部分细胞结构消失；而TAT-OSBP-1组和NS组肿瘤组织呈现典型肿瘤形态学特征,肿瘤细胞大小不一,形态各异,排列紊乱,核大深染,核分裂多见,核固缩少见,未见明显坏死区域。3.免疫组化结果显示,TAT-OSBP-1-MKK6(E)在裸鼠体内选择性靶向H08910细胞,其胞质内可见大量棕褐色颗粒,而肝组织仅部分细胞胞质内见少许棕褐色颗粒,正常卵巢上皮组织细胞内几乎未见棕褐色颗粒。4. TUNEL法检测结果显示,卵巢癌H08910移植瘤组织中可见大量棕褐色阳性细胞,凋亡指数AI为(26.3±3.1)%,而正常卵巢上皮组织和肝组织中几乎未见棕褐色阳性细胞。结论TAT-OSBP-1-MKK6(E)在体内外选择性靶向卵巢癌H08910细胞及移植瘤,并引起细胞及移植瘤的增殖抑制及凋亡作用,而对OSE细胞及卵巢、肝脏等正常组织无增殖抑制及凋亡作用。因此,TAT-OSBP-1-MKK6(E)重组融合蛋白卵巢癌靶向输送治疗系统可能为卵巢癌靶向治疗开辟新的有效途径。