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胃癌是一种多基因多因素的异质性疾病,是全球常见的恶性肿瘤形式,其发生发展的分子机制一直是生命科学研究的热点问题。从胃癌发生发展的分子网络入手,研究其调控机制,寻找其分子标记及其可能的干预位点,这是目前国内外肿瘤发生发展机制研究的热点和难点。
分化型胚胎软骨发育基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed genel,DEC1)是bHLH蛋白家族的一个新成员,含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域,它属于一个转录因子。近来发现它是一个与肿瘤的发生、发展密切相关的基因,其功能涉及肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及早老,但是相关研究尚处于起步阶段。DEC1广泛表达于大多数正常组织,包括软骨、肺、脾和肠等。已有研究发现DEC1在部分肿瘤组织中的表达升高,如乳腺癌、结肠癌、少突胶质瘤等;在多种肿瘤细胞系中也存在高表达,如白血病、结肠癌、肺腺癌、肾癌等。但是在其在胃癌的发生发展中的作用尚未明确。
RNA干扰((RNA interference,RNAi)是发生在转录水平上的基因阻断技术,是一种双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。目前,在某些病毒性疾病的治疗研究中己取得了一定的进展,在基因功能研究和基因治疗方面也己显示出巨大的应用前景。
我们利用RNA干扰技术,在体外设计并构建了能在细胞内特异性表达DEC1的shRNA载体,再将其转染入人胃癌细胞HGC-27及MGC-803细胞内,观察其对HGC-27及MGC-803细胞DEC1基因表达的抑制作用及其对细胞增殖的作用。
目的:
以人胃癌细胞株HGC-27及MGC-803为研究目标,利用RNA干扰技术,构建能在细胞内表达DEC1的pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector载体,通过体外实验探讨DEC1特异性shRNA抑制胃癌细胞株HGC-27及MGC-803的DEC1基因表达并抑制胃癌细胞的增殖,为进一步研究DEC1基因功能奠定理论基础,并为其治疗提供一个新的特异性基因治疗手段,同时为获得DEC1基因的最佳shRNA序列和RNAi应用于临床胃癌提供实验基础。
方法:
(1)选择两个符合条件的DEC1特异性RNA干涉靶序列,分别体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性载体pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector连接,转化到JM-109大肠杆菌中扩增,提取并纯化质粒。
(2)采用DNA琼脂糖凝胶电泳及应用引物Forward sequencing primer和reversesequencing primer进行PCR鉴定和序列鉴定,以确定合成的寡核苷酸是否已经转入载体质粒中及是否有碱基异常存在。确定载体构建成功后,转染入HGC-27及MGC-803细胞中。
(3)用脂质体/质粒载体不同剂量及浓度配比转染HGC-27及MGC-803细胞,荧光显微镜观察转染效率,筛选出最佳阳离子脂质体/质粒载体配比。
(4)在质粒转染入肿瘤细胞48小时后,分别用RT-PCR和Western Blot检测DEC1基因在mRNA及蛋白水平的变化,筛选出DEC1基因的最佳shRNA序列。
(5)用筛选出的DEC1-shRNA转染HGC-27及MGC-803细胞,MTT实验检测抑制DEC1基因后对HGC-27及MGC-803细胞增殖的作用。
结果:
(1)成功构建pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression LentivectorDEC1-1/2载体:①琼脂糖凝胶电泳检测发现,提取质粒大小与试剂盒中所提供阳性质控质粒大小相同,pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector分子量大小为7.8kb;②取质粒扩增菌液进行PCR反应,电泳发现目的条带为170bp左右,大小符合两段引物之间的长度;③基因测序结果表明插入片段的序列与合成的DEC1寡核苷酸序列完全相符,即成功构建shRNA表达载体。
(2)筛选出HGC-27和MGC-803最佳的阳离子脂质体/质粒载体转染复合物的配比为4μl:2μl和51μl:2μl。
(3)RT-PCR结果表明,所构建的两个质粒都可在mRNA水平上抑制DEC1的表达。
(4)蛋白水平DEC1基因表达的变化:Western Blot结果显示所构建的质粒均可抑制DEC1蛋白水平的表达。实验组shRNA-DEC1-1抑制效果较实验组shRNA-DEC1-2的抑制效果更明显。
(5)MTT实验表明抑制了DEC1基因表达后能够明显抑制HGC-27及MGC-803细胞的增殖。
结论:
在人胃癌细胞株HGC-27及MGC-803细胞中,利用构建的shRNA-RNAi表达载体明显干扰DEC1基因的表达,同时发现抑制DEC1基因的表达能够直接抑制人胃癌细胞株HGC-27及MGC-803的细胞增殖生长。这种方法不仅对体外研究DEC1基因功能有一定意义,而且为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗提供了实验依据。