慢性粒细胞白血病(CML),简称慢粒,是一种恶性克隆增殖性造血系统疾病,起源于骨髓多能造血干细胞。95%的慢粒患者在遗传学上具有Ph染色体,是9号染色体上的ABL基因与22号染色体上的BCR基因相互融合,最后形成bcr-abl融合基因,其编码的P210融合蛋白参与形成了慢粒特征性的分子生物学标志。因为P210蛋白具有失调的酪氨酸激酶活性,故bcr-abl融合基因可以导致白血病的发生。最后造成造血细胞出现过度增殖,对骨髓基质的粘附性较前下降和凋亡丧失等生物学特性的改变。BCR-ABL融合蛋白同时能激活多条与细胞增殖有关的信号通路,能改变DNA损伤修复途径,最后引起致命性的血液系统肿瘤。因此,目前慢粒的各种治疗方法都是围绕着bcr-abl基因和其编码的融合蛋白。CML治疗的显著性进展为酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的临床应用,在慢性期患者中疗效显著,在加速期和急变期的患者中同样能够明显延长患者的生存时间,是目前治疗慢性粒细胞白血病的主要药物之一,美国国家癌症综合网络(NCCN)首推伊马替尼作为治疗慢粒的药物。从2000年开始我国在临床上应用伊马替尼进行治疗CML,最近几年的临床观察结果显示,常规剂量伊马替尼(300~400 mg/d)对大部分慢性期Ph+CML患者可以取得满意的疗效。然而随着伊马替尼的临床应用,逐渐出现了耐药现象,且在慢性粒细胞白血病加速期(AP)或急变期(Bc)的患者中更为多见。近几年来关于伊马替尼耐药机制的研究很多,但普遍认为导致伊马替尼耐药的机制主要有:bcr-abl基因突变和扩增,继发其他核型改变,如del(7q)、de1(20q)、tri8、mono7等。现多项研究表明micro RNA(mi RNA)可以作为肿瘤抑制基因和(或)癌基因,mi RNA的异常表达通过促进癌细胞克隆的自我更新而引发一系列的耐药。miRNA是一类非编码的微小RNA分子,它的生成主要经历了原始转录本、前体和成熟体,最终的成熟体为19到24个碱基(nt)大小,能够通过与靶m RNA3’非编码区(UTR)特异性结合,在翻译和转录后水平调控靶基因的表达,与生物细胞的发展、分化、凋亡和增殖关系密切。所以本课题旨在利用Real-time quantitative PCR(RT-PCR)技术从细胞水平检测慢粒慢性期与病情进展的患者骨髓单个核细胞中mi RNA分子的表达有无差异,具体筛选的mi RNA分子分别为micro RNA-21(mi R-21)、mi R-10a、mi R-31、mi R-34a、mi R-155,如果表达确有明显差异,我们进一步观察上述mi RNA及其靶基因在CML敏感组与耐药组患者骨髓单个核细胞中的表达差异情况。为慢粒耐药患者提供新的治疗靶点。实验一目的:探讨慢性期和进展期慢粒患者mi RNA的表达水平方法:收集CML慢性期患者和病情进展患者的骨髓标本共35例。制备骨髓单个核细胞并抽提总RNA,利用紫外分光光度仪检测RNA提取液的浓度和纯度,最后利用RT-PCR技术检测mi R-21、mi R-10a、mi R-31、mi R-34a、mi R-155在慢性期和进展期慢粒患者中的相对表达水平。结果:CML患者服用伊马替尼后进展组的骨髓单个核细胞中mi R-21的表达明显高于慢性期组,mi R-10a、mi R-31、mi R-34a、mi R-155在两组患者骨髓单个核细胞中的表达水平并无显著差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:mi R-21的高表达可能与慢性粒细胞白血病患者服用伊马替尼期间出现病情进展有关。实验二目的:探讨伊马替尼治疗敏感组和耐药组患者mi R-21的表达水平方法:收集伊马替尼治疗敏感和耐药的慢粒患者骨髓标本共37例。制备骨髓单个核细胞并抽提总RNA,利用紫外分光光度仪检测RNA提取液的浓度和纯度,最后利用RT-PCR技术检测mi R-21在敏感组和耐药组患者中的相对表达水平。结果:CML耐药组患者骨髓单个核细胞中mi R-21的表达明显高于敏感组,差异有统计学意义(P<0.0001)。结论:mi R-21可能与CML患者口服伊马替尼后出现耐药存在密切关系。实验三目的:探讨mi R-21的靶基因在伊马替尼治疗敏感组和耐药组患者中的表达水平。方法:收集伊马替尼治疗敏感和耐药的慢粒患者骨髓标本共37例。制备骨髓单个核细胞并抽提总RNA,利用紫外分光光度仪检测RNA提取液的浓度和纯度,制备c DNA,最后利用RT-PCR技术检测PDCD4、PTEN在敏感组和耐药组患者中的相对表达水平。结果:CML耐药组患者骨髓单个核细胞中PDCD4相对表达水平显著低于敏感组,差异有统计学意义(P=0.0002)。耐药组的骨髓单个核细胞中PTEN相对表达水平显著低于敏感组,差异有统计学意义(P<0.0001)。结论:CML患者伊马替尼治疗期间出现耐药可能与mi R-21通过调控靶基因PDCD4、PTEN存在密切关系。