论文部分内容阅读
本文主要由两个部分组成，研究一以杂食性鱼类异育银鲫“中科3号”（Carassius auratus gibelio var.CASⅢ）为研究对象，在养殖全周期过程中饲喂五种不同淀粉水平饲料，探究不同养殖阶段饲料糖的最适水平及代谢特征差异;研究二以分类地位相近但糖利用差异较大的杂食性鱼类黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco♀×Pelteobaggrus vachelli♂）和肉食性鱼类长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)为研究对象，分别饲喂高淀粉和低淀粉饲料，比较microRNAs调控不同食性鱼类糖代谢的差异机制。
研究一:对异育银鲫“中科3号”分别饲喂淀粉水平为3％(S3)，13％(S13)，23％(S23)，33％(S33)，43％(S43)的饲料340d，并将全养殖周期划分为幼鱼期（第63d取样，D63）、养成前期（第110d取样，D110）、越冬期（第223d取样，D223）、越冬后（第275d取样，D275）和养成中后期(第340d取样，D340)五个阶段，通过比较不同处理组的生长性能、血液生化指标及糖代谢关键基因表达的差异，探究不同养殖阶段异育银鲫对饲料淀粉的需求及其代谢差异。
主要结果如下:
1.幼鱼期，异育银鲫肠道淀粉酶活性较低且不随饲料淀粉水平变化，自养成前期之后鱼体肠道淀粉酶活性增强且随饲料淀粉水平的变化出现波动。
2.幼鱼期，异育银鲫glut2表达对饲料淀粉含量不敏感，其他阶段异育银鲫glut2基因表达随饲料淀粉含量升高而升高。
3.幼鱼期与养成前期异育银鲫的糖脂转化能力较强。
4.在各个养殖阶段，饲喂不同淀粉组的异育银鲫糖酵解比糖异生更敏感。
5.幼鱼期，养成前期，越冬后，养成中后期异育银鲫受适宜饲料淀粉水平分别为23％，13％，43％，33％。
研究二:对长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)和杂交黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco♀×Pelteobaggrus vachelli♂）分别饲喂高淀粉饲料(长吻鮠为25％(LS25)，黄颡鱼为40％(PS40))和低淀粉饲料(长吻鮠为10％(LS10)，黄颡鱼为25％(PS25))，分析长吻鮠和杂交黄颡鱼应答不同淀粉饲料时糖代谢机制的差异。取不同处理组长吻鮠和杂交黄颡鱼肝脏组织做高通量测序以预测差异表达的microRNA的序列和富集的通路，对microRNA的靶基因进行转录组分析以预测差异靶基因的序列、功能及富集的通路，利用蛋白互作(PPI)联合分析确定差异表达的microRNA及差异表达的靶基因的对应关系，预测调控糖代谢通路相关靶基因的microRNAs，进一步比较分析microRNAs对长吻鮠、杂交黄颡鱼糖代谢的调控机制。
主要结果如下:
1.高淀粉饲料对长吻鮠和黄颡鱼的生长无显著影响。
2.长吻鮠的差异表达microRNAs有16个，主要富集于癌症相关代谢通路，与代谢相关的通路有MAPK信号通路、C型肝炎和FOXO信号通路，黄颡鱼的差异表达microRNAs有11个，主要富集于生物信号的传导，与代谢相关的信号通路有MAPK信号通路，JAK-STAT信号通路。
3.对差异表达的microRNAs的靶基因进行差异分析及KEGG富集和聚类分析发现长吻鮠的差异靶基因更多富集于与疾病相关的通路包括胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝等，而黄颡鱼则更多富集于与代谢相关的通路包括糖酵解/糖异生、MAPK信号通路、胰岛素相关信号通路等。
4.高淀粉饲料显著诱导了长吻鮠胰岛素的分泌，胰高血糖素无显著的变化，胰岛素抵抗指数上升，高淀粉饲料显著诱导了黄颡鱼胰岛素和胰高血糖素的分泌，胰岛素抵抗指数无显著变化，摄食相同淀粉水平饲料后长吻鮠的胰岛素分泌及胰岛素抵抗指数显著高于长吻鮠。
5.高淀粉条件下，长吻鮠血浆游离脂肪酸含量上升，血浆甘油三酯下降，全鱼粗脂肪含量下降，肝脏粗脂肪含量上升，而黄颡鱼各指标均无显著变化。摄食同为25％淀粉水平饲料时，长吻鮠肝脏脂肪含量显著高于黄颡鱼。
6.摄食高淀粉饲料后黄颡鱼肌糖原含量显著上升，长吻鮠肌糖原含量显著下降。摄食高淀粉饲料后黄颡鱼糖原代谢相关基因表达量上升，长吻鮠无显著变化。
7.黄颡鱼和长吻鮠let-7及miR-125b表达趋势相同，它们调控的过程有糖原代谢、糖异生、糖脂转化;黄颡鱼miR-194a及103表达上调，长吻鮠无显著变化，它们调控的过程有胰岛素分泌、糖异生、糖脂转化;黄颡鱼和长吻鮠miR-132b及miR-144表达趋势相反，它们调控的过程有糖原代谢、胰岛素通路、糖脂转化。
8.在长吻鮠和黄颡鱼中表达趋势相反的miR-132b及miR-144的共同靶基因为ppp1r3c，双荧光素酶和过表达实验表明，miR-132b通过调控关键因子ppp1r3c进而调控pp1的表达水平，pp1通过去磷酸化作用促进糖原的合成，抑制糖原的分解，进而调控鱼体糖原代谢。
综上所述，不同养殖阶段和鱼类食性对饲料淀粉的利用及其糖代谢均有较大的影响，异育银鲫“中科3号”全养殖周期对饲料淀粉的需求差异较大，这是鱼体本身的生理状态和外部环境综合作用的影响。长吻鮠和杂交黄颡鱼在生态学分类上虽属同一科，但比较发现两种鱼类的糖代谢差异很大，不同淀粉饲喂后长吻鮠和杂交黄颡鱼通过microRNAs介导糖代谢的调控机制完全不同。
研究一:对异育银鲫“中科3号”分别饲喂淀粉水平为3％(S3)，13％(S13)，23％(S23)，33％(S33)，43％(S43)的饲料340d，并将全养殖周期划分为幼鱼期（第63d取样，D63）、养成前期（第110d取样，D110）、越冬期（第223d取样，D223）、越冬后（第275d取样，D275）和养成中后期(第340d取样，D340)五个阶段，通过比较不同处理组的生长性能、血液生化指标及糖代谢关键基因表达的差异，探究不同养殖阶段异育银鲫对饲料淀粉的需求及其代谢差异。
主要结果如下:
1.幼鱼期，异育银鲫肠道淀粉酶活性较低且不随饲料淀粉水平变化，自养成前期之后鱼体肠道淀粉酶活性增强且随饲料淀粉水平的变化出现波动。
2.幼鱼期，异育银鲫glut2表达对饲料淀粉含量不敏感，其他阶段异育银鲫glut2基因表达随饲料淀粉含量升高而升高。
3.幼鱼期与养成前期异育银鲫的糖脂转化能力较强。
4.在各个养殖阶段，饲喂不同淀粉组的异育银鲫糖酵解比糖异生更敏感。
5.幼鱼期，养成前期，越冬后，养成中后期异育银鲫受适宜饲料淀粉水平分别为23％，13％，43％，33％。
研究二:对长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)和杂交黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco♀×Pelteobaggrus vachelli♂）分别饲喂高淀粉饲料(长吻鮠为25％(LS25)，黄颡鱼为40％(PS40))和低淀粉饲料(长吻鮠为10％(LS10)，黄颡鱼为25％(PS25))，分析长吻鮠和杂交黄颡鱼应答不同淀粉饲料时糖代谢机制的差异。取不同处理组长吻鮠和杂交黄颡鱼肝脏组织做高通量测序以预测差异表达的microRNA的序列和富集的通路，对microRNA的靶基因进行转录组分析以预测差异靶基因的序列、功能及富集的通路，利用蛋白互作(PPI)联合分析确定差异表达的microRNA及差异表达的靶基因的对应关系，预测调控糖代谢通路相关靶基因的microRNAs，进一步比较分析microRNAs对长吻鮠、杂交黄颡鱼糖代谢的调控机制。
主要结果如下:
1.高淀粉饲料对长吻鮠和黄颡鱼的生长无显著影响。
2.长吻鮠的差异表达microRNAs有16个，主要富集于癌症相关代谢通路，与代谢相关的通路有MAPK信号通路、C型肝炎和FOXO信号通路，黄颡鱼的差异表达microRNAs有11个，主要富集于生物信号的传导，与代谢相关的信号通路有MAPK信号通路，JAK-STAT信号通路。
3.对差异表达的microRNAs的靶基因进行差异分析及KEGG富集和聚类分析发现长吻鮠的差异靶基因更多富集于与疾病相关的通路包括胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝等，而黄颡鱼则更多富集于与代谢相关的通路包括糖酵解/糖异生、MAPK信号通路、胰岛素相关信号通路等。
4.高淀粉饲料显著诱导了长吻鮠胰岛素的分泌，胰高血糖素无显著的变化，胰岛素抵抗指数上升，高淀粉饲料显著诱导了黄颡鱼胰岛素和胰高血糖素的分泌，胰岛素抵抗指数无显著变化，摄食相同淀粉水平饲料后长吻鮠的胰岛素分泌及胰岛素抵抗指数显著高于长吻鮠。
5.高淀粉条件下，长吻鮠血浆游离脂肪酸含量上升，血浆甘油三酯下降，全鱼粗脂肪含量下降，肝脏粗脂肪含量上升，而黄颡鱼各指标均无显著变化。摄食同为25％淀粉水平饲料时，长吻鮠肝脏脂肪含量显著高于黄颡鱼。
6.摄食高淀粉饲料后黄颡鱼肌糖原含量显著上升，长吻鮠肌糖原含量显著下降。摄食高淀粉饲料后黄颡鱼糖原代谢相关基因表达量上升，长吻鮠无显著变化。
7.黄颡鱼和长吻鮠let-7及miR-125b表达趋势相同，它们调控的过程有糖原代谢、糖异生、糖脂转化;黄颡鱼miR-194a及103表达上调，长吻鮠无显著变化，它们调控的过程有胰岛素分泌、糖异生、糖脂转化;黄颡鱼和长吻鮠miR-132b及miR-144表达趋势相反，它们调控的过程有糖原代谢、胰岛素通路、糖脂转化。
8.在长吻鮠和黄颡鱼中表达趋势相反的miR-132b及miR-144的共同靶基因为ppp1r3c，双荧光素酶和过表达实验表明，miR-132b通过调控关键因子ppp1r3c进而调控pp1的表达水平，pp1通过去磷酸化作用促进糖原的合成，抑制糖原的分解，进而调控鱼体糖原代谢。
综上所述，不同养殖阶段和鱼类食性对饲料淀粉的利用及其糖代谢均有较大的影响，异育银鲫“中科3号”全养殖周期对饲料淀粉的需求差异较大，这是鱼体本身的生理状态和外部环境综合作用的影响。长吻鮠和杂交黄颡鱼在生态学分类上虽属同一科，但比较发现两种鱼类的糖代谢差异很大，不同淀粉饲喂后长吻鮠和杂交黄颡鱼通过microRNAs介导糖代谢的调控机制完全不同。