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以往研究发现,在没有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的参与下,机械应力直接激活AngⅡ 1型受体(AT1R)引起心肌肥厚。AT1R阻滞剂(ARB)中的反向激动剂,而不是中和拮抗剂,可有效地阻断这种非激动剂依赖的AT1R的活性以及随之而来的心肌肥大。基于这一现象,目前很多研究都集中于探索新的ARB类药物。然而,寻找一个新的靶点可能会产生事半功倍的效果。在本研究中,我们发现,凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)在机械应力直接诱导的心肌肥厚的病理过程中起着关键作用。本试验首先研究了LOX-1是否参与了机械应力直接诱导的心肌肥厚,我们在血管紧张素原基因敲除(ATG-/-)小鼠上进行横主动脉缩窄术(TAC)以达到压力超负荷,或者在体外分离培养1-3日龄的ATG-/-小鼠的原代心肌细胞并进行机械牵张,来诱导心肌肥厚模型。结果发现,在体试验中用LOX-1中和抗体(NAB)或离体试验中用LOX-1-shRNA,分别显著减少压力超负荷或机械牵张直接诱导的心肌肥厚。其次,通过转染LOX-1或AT1R的质粒到无内源性AngⅡ的COS7细胞中,并对表达了AT1R或LOX-1的细胞进行牵张,我们发现LOX-1可以介导机械牵张引起的JNK的磷酸化,因磷酸化JNK是心肌肥厚的重要标志,表明LOX-1可能通过JNK信号直接介导机械应力诱导的心肌肥厚。最后,通过转染LOX-1或AT1R的质粒到无内源性AngⅡ的COS7细胞中,并对表达了AT1R或LOX-1的细胞进行牵张,我们发现Src激酶,而不是Gaql 1或Jak2,在机械牵张诱导的LOX-1-JNK信号中被激活。这表明,Src激酶参与了机械应力通过LOX-1-JNK信号通路诱导的心肌肥厚。总的来说,本研究发现,LOX-1-Src-JNK信号通路可以不依赖于AngⅡ的参与而被机械应力直接激活。本研究提示,对于压力超负荷引起的心肌肥厚,LOX-1是一个很有前景的的治疗靶点。第一部分 LOX-1参与压力超负荷直接诱导的心肌肥厚目的：探讨LOX-1是否参与了压力超负荷引起的心肌肥厚。方法：选取10周龄的ATG-/-小鼠进行TAC以建立压力超负荷诱导的心肌肥厚模型。奥美沙坦(OLM,3mg·kg-1体重·day-1,口服,阳性对照)或LOX-1中和抗体(NAB,0.06 mg·kg-1体重-day-1,腹腔注射)从TAC术当天开始给药。2周后,对小鼠进行超声心动图检测,心脏血流动力学检测,心脏组织学和形态学检测,并检测肥厚相关基因和蛋白的表达。结果：超声心动图显示,和Sham组相比,TAC组的左心室壁厚度增加,左室内径减小,心功能基本正常,小鼠的心重/体重比率(HW/BW)增加,心肌细胞横截面积(CSA)也增加。此外,肥厚相关基因ANP,BNP和SAA的mRNA水平在TAC组明显升高。以上所有的改变说明TAC组在术后2周出现了代偿性的心肌肥厚。所有这些肥厚反应在OLM或NAB治疗下被明显改善。检测和心肌肥厚相关的分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路发现,TAC所诱导的磷酸化的ERKs、P38以及JNKs的水平被OLM显著降低。而在NAB处理组,只有ERKs和JNKs的磷酸化被明显阻断。结论：这些证据表明,LOX-1参与了压力负荷引起的心肌肥厚。第二部分 LOX-1参与机械牵张直接诱导的心肌细胞肥大目的：探讨LOX-1是否参与了体外机械牵张装置诱导的心肌细胞肥大。方法：从1-3日龄ATG-/-小鼠的心脏分离出原代心肌细胞并在预先铺有鼠尾胶的硅胶皿中培养。贴壁的心肌细胞用control-shRNA或LOX-1-shRNA处理4天后再机械牵张至原始长度的120%,时间持续8min/15min/30min或24h以分别进行细胞总蛋白或RNA的提取。结果：和control-shRNA相比,LOX-1-shRNA预处理显著降低机械牵张诱导心肌细胞表面积的增加、ERKs和JNKs的磷酸化和肥厚相关基因ANP和SAA的mRNA水平,但不影响机械牵张诱导的P38的磷酸化。结论：这些证据表明,LOX-1参与了机械牵张诱导的心肌细胞肥大。第三部分 LOX-1直接介导机械牵张诱导的JNKs的磷酸化目的：探讨LOX-1是否能够直接介导机械应力诱导的MAPK的磷酸化。方法：COS7细胞因缺乏内源性AngⅡ、AT1R以及LOX-1的表达被用在这部分研究。我们瞬时转染空质粒、LOX-1或AT1R质粒到培养于硅胶皿的COS7细胞中,24 h后,机械牵张细胞到原始长度的120%,持续8 min、15min或30 min以分别检测pERKs、pP38或pJNKs的水平。结果：和空质粒转染组相比,AT1R转染组的ERKs、P38和JNKs的磷酸化水平在机械牵张刺激后都被上调,这与以往的研究一致。JNKs的磷酸化,而不是ERKs和P38的磷酸化,在转染LOX-1质粒的COS7细胞中被机械牵张直接诱导。结论：这些结果表明,LOX-1直接介导机械牵张诱导的JNKs的磷酸化。mRNA水平,但不影响机械牵张诱导的P38的磷酸化。结论：这些证据表明,LOX-1参与了机械牵张诱导的心肌细胞肥大。第四部分 Src激酶参与机械牵张直接激活的LOX-1-JNK通路目的：研究G蛋白和非受体型酪氨酸激酶,如Janus激酶(JAK)家族和Src家族,是否参与机械牵张激活的LOX-1-JNK通路。方法：瞬时转染空质粒、LOX-1或AT1R质粒到培养于硅胶皿的COS7细胞,24h后,机械牵张细胞到原始长度的120%,持续5min,5min或10min以分别检测胞浆Gaq11,pJak2,和pSrc。PP2(Src酪氨酸激酶抑制剂,5μM)被用来探讨机械牵张激活的LOX-1-JNK通路是否需要Src激酶的参与。结果：和空质粒转染组相比,机械牵张AT1R质粒转染组后Gaq11亚基发生了明显的胞浆转位,Jak2和Src的磷酸化都显著上调,这与以前的研究结果一致。机械牵张LOX-1质粒转染组后Gaq11亚基没有发生明显的胞浆转位,Jak2的磷酸化也没有明显上调。但是,Src的磷酸化在机械牵张LOX-1质粒转染组显著增加。进一步实验显示,PP2抵消了机械牵张在转染LOX-1质粒的COS7细胞中所诱导的JNKs的活化。结论：这些结果表明,Src激酶,而不是Gaq11或Jak2,参与机械牵张激活的LOX-1-JNK通路。结论1.在没有Ang Ⅱ的参与下,LOX-1可以直接介导机械应力诱导的心肌肥厚。2.机械应力可以部分通过LOX-1-Src-JNK信号通路诱导心肌肥厚。潜在的应用价值的和创新点1.我们探讨了在没有Ang Ⅱ的参与下,机械应力直接诱导的心肌肥厚的机制。2.本研究提示机械应力可以部分通过LOX-1-Src-JNK信号通路直接诱导心肌肥厚。3.LOX-1可以作为压力超负荷直接引起的心肌肥厚的新靶点。4.本研究指引了一个新的治疗策略,开发针对LOX-1的拮抗剂对压力超负荷诱导的心肌肥厚的治疗将大有裨益。