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Na?ve胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)目前被认为是真正全能的干细胞,其在细胞分化、基因遗传修饰和再生医学方面具有重要的研究和应用价值。但目前,除小鼠和大鼠外,未能成功地实现持久稳定地培养其他物种na?ve ESCs。因猪的解剖、生理及遗传学方面与人类相似,而被当作人类疾病的研究模型和异种器官移植的潜在供体。近期研究表明,可以利用携带转录因子的慢病毒载体转染囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),并将其接种于含2i(CHIR99021和kenpaullone)的LIF(leukemia inhibitory factor)培养液中,获得猪类na?ve ESCs,但该方法可能造成不同的ICM细胞之间整合和表达外源转录因子的不均一性;除了重编程因子这个关键因素外,培养体系也是影响na?ve ESCs形成的重要因素;因此,本研究第一部分将iPSCs技术引入传统胚胎干细胞建立方法中,将重编程因子转入猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)中,通过体细胞核移植获得克隆胚胎,待胚胎发育至囊胚时并将ICM接种于不同的培养体系,同时添加强力霉素(doxycycline hyclate,DOX)以诱导外源重编程因子的表达,从而初步探索猪na?ve ESCs的建系方法;第二部分建立表达重组猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系,为下一步优化猪naive ESCs培养条件奠定基础。目的利用iPSCs技术辅助建立猪na?ve ESCs系;建立高效表达重组猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系,为下一步辅助建立和培养猪na?ve ESCs奠定基础。方法1.利用iPSCs技术辅助建立猪na?ve ESCs系:利用限制性内切酶酶切和DOX诱导鉴定Tet O-FUW-OSKM表达载体和FUW-M2rt TA激活表达载体的正确性;将Tet O-FUW-OSKM表达载体和FUW-M2rt TA激活表达载体共转染猪胚胎成纤维细胞,经zeocin筛选后得到转基因阳性细胞;以转基因阳性细胞为供体细胞,通过体细胞核移植方法获得囊胚;通过免疫外科法得到囊胚ICM;将其接种于不同培养体系进行培养;对得到的胚胎干细胞克隆进行传代培养及鉴定。2.建立高效表达重组猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系:以猪PEF的总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增猪白血病抑制因子基因(LIF),将LIF c DNA连接到真核表达载体p CAGDNA3的启动子下游,构建LIF基因真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;利用核转染的方法将p CAGDNA3-p LIF质粒转入猪胚胎成纤维细胞;对转染细胞进行G418筛选,得到稳定高效表达重组猪LIF的猪胚胎成纤维细胞PEF-p LIF;利用RT-PCR、western blotting,鉴定PEF-p LIF中LIF基因及LIF表达情况;使用PEF-p LIF细胞作为饲养层培养小鼠ESCs,通过对小鼠ESCs进行碱性磷酸酶染色及细胞免疫荧光染色,对PEF-p LIF维持干细胞干性功能进行初步验证。结果1.利用iPSCs技术辅助建立猪na?ve ESCs系:经酶切和DOX诱导鉴定,Tet O-FUW-OSKM表达载体和FUW-M2rt TA激活表达载体的正确,可用于后续实验;核转染后经zeocin筛选得到5个转基因阳性细胞株;经体细胞核移植后,共得到343个囊胚;将内细胞团接种于含DOX的不同培养体系,结果如下:1)MEF/2i(CH+PD)/LIF/VPA/5-AZA培养系统中未培养出ESCs;2)MEF/2i(CH+KP)/LIF系统中培养出2个为三维立体形态的ESCs,1个为扁平形态的ESCs,但均未能稳定传代;3)MEF/FGF/LIF/2i(CH+KP)系统中起初得到3个扁平形态的ESCs,但均未能稳定传代;4)FGF/STO系统中培养出1个扁平形态的ESCs,但因核型正确率只有13.6%,放弃传代。2.建立高效表达重组猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系:构建了真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;并将其成功转入PEF中,获得高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;以PEF-p LIF作为饲养层成功培养克隆形态正常的小鼠ESCs。结论1.使用iPSCs技术辅助建立猪na?ve ESCs的方法,目前未能成功建立猪na?ve ESCs系,还需进一步调整培养方法。2.稳定高效表达重组猪LIF蛋白的猪胚胎成纤维细胞系PEF-p LIF可作为饲养层维持小鼠ESCs的未分化状态,下一步将作为饲养层细胞,用于猪na?ve ESCs建系研究。