目的:慢性支气管炎(CB)是呼吸系统的常见病,是一种气管支气管粘膜以及周围组织的一种非特异性炎症,主要表现为咳嗽、咳痰或伴有喘息及反复发作。随着人口的高龄化与大气的污染,慢性支气管炎的发病日趋增多,严重影响人们的身体健康。肺气虚证是慢性支气管炎的主要证候形式。近年来,许多学者结合现代科技手段,从多方面对慢性支气管炎进行了较为广泛的研究,认为慢性支气管炎从炎症的角度来分析,可以归纳为促炎因子和抗炎因子体系失衡引起的支气管炎症。促炎因子和抗炎因子分泌的来源大约可以分三大类:T细胞分泌、单核巨噬细胞分泌、中性粒细胞(PMN)分泌。TH1和TH2细胞是由T细胞进一步分化而来,可以分泌促炎因子和抗炎因子,与支气管炎症密切相关。但关于TH1和TH2相关细胞因子对肺气虚证的慢性支气管炎发病的影响未见报道。本研究采用病证合一的动物模型,以改良烟熏法复制慢性支气管炎肺气虚证大鼠模型,通过检测血清和肺组织中的IL-4和IFN-γ的含量,并以补气活血为法,组成补气活血方进行干预,探讨其治疗作用的机制,从而进一步揭示慢性支气管炎肺气虚证的证候本质,并为临床防治该病证提供实验依据。方法:将50只Sprague Dawley(SD)大鼠(雌雄各半)置于实验环境中适应性饲养1周后,随机分为5组(每组10只):①正常对照组(正常组,control group);②CB模型组(模型组,model group);③补肺汤组(阳性药物对照组,prednisone group);④补气活血方低剂量组(低剂量组,low-dose group);⑤补气活血方高剂量组(高剂量组,high-dose group)。根据文献方法,采用改良烟熏法复制慢性支气管炎肺气虚证动物模型。将造模各组大鼠置于特制的1m×1m×1m的烟室中,用刨花﹑锯末﹑烟叶各50g点燃熏烟,每日2次,每次30分钟,持续40天。正常对照组则置于正常无烟环境中饲养。5组均于造模结束后第2天起连续灌胃生理盐水或药物21天。给正常组与模型组大鼠灌服生理盐水(10ml/kg)每日1次灌胃;给低剂量组和高剂量组大鼠灌服补气活血方中药水煎剂(12.8g/kg、25.6/kg,相当于临床成人用药量的7倍和14倍),每日1次灌胃;给补肺汤组大鼠灌服补肺汤中药水煎剂(8.36g/kg,相当于临床成人用药量的7倍),每日1次灌胃。检测样本的制备:5组均连续灌胃21天,各组动物均于治疗结束后,采用10%水合氯醛0.35ml/100g麻醉,腹主动脉取血,3500r/min离心5 min。分离出血清,-20℃冻存待检。取右侧肺脏中部组织1cm×1cm×1cm大小,用4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片。肺组织匀浆的制备:将肺组织用冰生理盐水冲洗,滤纸吸湿后,称取湿重0.3g左右,加入预冷的生理盐水,在冰浴中快速研磨制成10%的肺组织匀浆。4℃6000r/min离心5 min,提取上清液,-20℃冻存待检。行HE染色和SP免疫组化染色,光学显微镜下观察肺组织形态结构以及IL-4、IFN-γ的表达情况。同时,用放射免疫法检测血清和肺组织中IL-4、IFN-γ等指标变化。结果:1一般状态观察正常组大鼠饮食如常,反应灵敏,体毛顺滑光泽,二便正常,无死亡现象;模型组大鼠存在不同程度的咳嗽、呼吸困难,伴有倦怠、蜷缩少动、行动迟缓、精神萎靡、毛枯体瘦等表现;高、低剂量组大鼠,尤其是随着用药时间的延长,精神渐趋好转,呼吸渐趋平稳,毛发愈发光整,活动增大,食量增加;补肺汤组大鼠状态亦趋好转。2支气管、肺组织形态学观察2.1肉眼观察正常组大鼠双肺外观无异常,肺叶轮廓清晰,表面光滑柔软,粉红色,弹性良好;模型组大鼠双肺呈膨胀状态,灰黑色斑点,体积增大,肺表面略显不平,表面无光泽,边缘有点状出血;高低剂量组和补肺汤组支气管及肺组织部分色暗红,偶见点状出血,与模型组比较有明显差别。2.2光镜观察参照Szapiel等方法用HE染色评定支气管、肺组织炎性程度。正常组可见细支气管黏膜上皮完整,细胞排列整齐,细支气管壁及肺泡无明显病理形态学改变(Fig.1、2)。模型组可见细支气管管腔增大,管壁明显增厚,部分上皮细胞坏死脱落,伴有慢性炎细胞及少量中性粒细胞浸润,小静脉有淤血现象(Fig.3、4)。经用药干预,各治疗组大鼠支气管炎性程度明显好于模型组。(Fig.5-10)。2.3免疫组织化学形态观察和半定量结果:正常组大鼠细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IL-4呈较强的阳性表达模型组大鼠细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IL-4呈较弱的阳性表达(Fig.12)。阳性信号均呈棕黄色。补肺汤组与低剂量组细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IL-4呈较弱的阳性表达(Fig.13、14);高剂量组IL-4表达呈较强的阳性信号。与正常组相似,阳性反应主要见于细支气管粘膜上皮胞浆(Fig.15)。半定量结果显示:与正常组比较,模型组大鼠肺组织中IL-4明显降低(P <0.01);与模型组相比,三治疗组大鼠肺组织中IL-4明显升高(P <0.01或P<0.05);三治疗组间比较,高剂量组与低剂量组大鼠肺组织中IL-4含量较补肺汤组明显升高(P<0.01);高剂量组与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。正常组大鼠细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IFN-γ呈较弱的阳性表达(Fig.16);模型组大鼠细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IFN-γ呈较强的阳性表达(Fig.17)。阳性信号均呈棕黄色。补肺汤组与低剂量组细支气管粘膜上皮细胞胞浆中IFN-γ呈较强的阳性表达(Fig.18、19);高剂量组IFN-γ表达呈较弱的阳性信号。与正常组相似,阳性反应主要见于细支气管粘膜上皮胞浆(Fig.20)。半定量结果显示:与正常组比较,模型组大鼠肺组织中IFN-γ明显升高(P<0.01);与模型组相比,三治疗组大鼠肺组织中IFN-γ明显降低(P <0.01或P <0.05);三治疗组间比较,高剂量组大鼠肺组织中IFN-γ含量较低剂量组和补肺汤组明显升高(P<0.01);低剂量组与补肺汤组比较无统计学意义(P>0.05)。(见Table1)3各组大鼠血清及肺组织中细胞因子IL-4、IFN-γ含量变化及TH1和TH2的比值变化3.1各组大鼠血清及肺组织中细胞因子IL-4含量变化与正常组比较,模型组大鼠血清中的IL-4含量明显降低(P <0.01);与模型组比较,三治疗组大鼠血清中IL-4含量均明显升高(P<0.01);三治疗组间比较,高剂量组血清中IL-4含量均高于补肺汤组和低剂量组(P<0.01或P <0.05);低剂量组血清中IL-4含量与补肺汤组比较无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组大鼠肺组织中的IL-4含量明显降低(P<0.01);与模型组比较,三治疗组大鼠肺组织中IL-4含量均明显升高(P<0.01);三治疗组间比较,高剂量组和低剂量组大鼠肺组织中IL-4含量较补肺汤组明显升高(P <0.01或P <0.05);高剂量组与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。(见Table2)3.2各组大鼠血清及肺组织中细胞因子IFN-γ含量变化与正常组比较,模型组大鼠血清中IFN-γ含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,三治疗组大鼠血清中IFN-γ含量明显降低(P<0.01);三治疗组间比较,高剂量组与低剂量组血清中IFN-γ含量明显低于补肺汤组(P<0.01或P<0.05);高剂量组血清中IFN-γ含量较低剂量组明显降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠肺组织中IFN-γ含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,三治疗组肺组织中IFN-γ含量明显降低(P<0.01);三治疗组间比较,高剂量组和低剂量组大鼠肺组织中IFN-γ含量明显低于补肺汤组(P<0.01);高剂量组与低剂量组肺组织中IFN-γ含量无明显统计学意义(P>0.05)。(见Table3)3.3各组大鼠血清及肺组织中TH1和TH2的比值变化与正常组比较,模型组大鼠血清中TH1/TH2明显升高(P<0.01);与模型组相比,三治疗组大鼠血清中TH1/TH2明显降低(P<0.01);三治疗组间比较,高剂量组和低量剂组大鼠血清中TH1/TH2明显低于补肺汤组(P<0.01);高剂量组和低剂量组大鼠血清中TH1/TH2无明显统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组大鼠肺组织中TH1/TH2明显升高(P<0.01);与模型组相比,三治疗组大鼠肺组织中TH1/TH2明显降低(P<0.01或P<0.05);三治疗组间比较,高剂量组大鼠肺组织中TH1/TH2明显低于补肺汤组和低剂量组(P<0.01);低剂量组和补肺汤组大鼠肺组织中TH1/TH2无明显统计学意义(P>0.05)。(见Table4)结论:1慢性支气管炎肺气虚证状态下,血液和肺组织中能拮抗炎症介质的释放而减轻气道炎症的细胞因子IL-4含量的明显降低,以及促进炎症反应发生的细胞因子IFN-γ含量的明显增加,共同介导了慢性支气管炎肺气虚证的非特异性炎症反应。此种变化,是慢性支气管炎肺气虚证可能的发病机制之一。2补气活血方可以通过升高血清、肺组织中IL-4含量,降低血清、肺组织中IFN-γ的含量变化和TH1/TH2比值,从而减弱或抑制慢性支气管炎肺气虚证中的非特异性炎症反应,达到防治慢性支气管炎肺气虚证的目的。