研究背景和目的:Exendin-4是一种从美洲希拉毒蜥（Heloderma Suspectum）唾液中提取的胰高血糖素样肽-1 （GLP-1）类似物，已于 2005年经美国食品药物管理局（FDA）认证获准用于 2 型糖尿病患者的临床治疗。与 GLP-1相比，Exendin-4 具有半衰期长、与受体结合亲和力高、易通过血脑屏障等多种优势。其与胰岛β细胞膜上的GLP-1 受体（GLP-1R）特异性结合后可介导血糖依赖性降糖、促进细胞生存等多种生物学效应。GLP-1R在中枢及周围神经系统中的广泛分布，为 Exendin-4在神经系统疾病治疗中的应用提供了初步的理论基础。近年来的研究表明，GLP-1R 激活后可促进细胞增殖分化、增强突触可塑性、抑制食欲、减轻体重、改善脂质代谢等。由此，Exendin-4的神经保护特性也日益受到人们的关注。目前 Exendin-4的研究领域主要集中于神经退行性疾病，而其与脑血管病的相关性研究则相对较少。神经元及胰岛β细胞均具有高度发达的内质网，对 ER 内稳态紊乱极为敏感。多种病理改变均可破坏内质网功能，进而触发内质网应激（ESR）及未折叠蛋白反应（UPR）。这种细胞自我保护机制同时存在于糖尿病、脑梗死，并参与了疾病的发生发展。研究发现，Exendin-4与胰岛β细胞膜上的GLP-1R 特异性结合后可激活 cAMP/PKA 信号转导通路，抑制内质网相关性细胞凋亡。由此可以推测Exendin-4的抗凋亡机制可能同样适用于脑缺血再灌注损伤。如能深入探讨其相关机制，可为缺血性脑血管病的防治提供新思路。本研究旨在以原代培养的大鼠皮质神经元建立氧糖剥夺/复供（OGD/R）离体模型模拟体外神经元缺血再灌注（I/R）损伤，观察 Exendin-4 对体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元 ESR 相关基因表达的影响，并探讨其可能机制。　　 方法:体外培养Sprague Dawley 乳鼠皮质神经元，随机分为对照组、模型组、治疗组，按照 MTT 检测结果筛选出的最低有效浓度给药。治疗组于建模前 2 h、建模中均给予 Exendin-4 ；模型组于体外模拟缺血再灌注损伤（氧糖剥夺/复供，OGD/R）并给予等体积三蒸水；对照组始终正常培养。免疫荧光染色鉴定神经元纯度，RT-PCR检测GLP-1R mRNA表达，ELISA 法检测神经元细胞内cAMP 水平，MTT 法测定神经元存活率，Hoechest 33258 荧光染色及流式细胞术 AnnexinV、PI 双标法检测神经元凋亡率，real-time PCR检测C/EBP 同源蛋白（CHOP）、生长抑制和 DNA损伤基因34 （GADD34）基因表达，免疫荧光及 Western-blot 免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白78 （GRP78）、CHOP 蛋白表达。　　 结果:　　 1.Hoechest 33258 检测结果显示，模型组神经元凋亡率较对照组明显增加，并随复供时间的延长而呈上升趋势，镜下可见细胞凋亡发生的形态学改变（细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，荧光着色强）；　　 2.RT-PCR检测结果显示，原代大鼠皮质神经元中 GLP-1R基因呈阳性表达；　　 3.ELISA 检测结果显示，0.3 μg/ml Exendin-4 作用后，神经元内 cAMP 含量迅速增加，15min 达峰值，30 min 降至基线水平；　　 4.MTT 结果显示，模型组神经元存活率较对照组明显下降，Exendin-4 干预后神经元存活率提高，在0.2 ~ 0.8 μg/ml 浓度范围内呈剂量依赖性；　　 5.Hoechest 33258 法及流式细胞术 Annexin V、PI 双标法检测结果均显示，ODG/R 12 h 时治疗组（0.4 μg/ml）细胞凋亡率明显低于模型组；　　 6.免疫荧光及 Western-blot 免疫印迹结果均显示，ODG/R 12 h时模型组 GRP78、CHOP 蛋白表达增加（尤以CHOP 为著），Exendin-4 （0.4 μg/ml）干预后 GRP78表达进一步增加，CHOP表达则降低；　　 7.real-time PCR检测结果显示，模型组 CHOP mRNA、GADD34 mRNA 含量随复供时间延长呈上升趋势，治疗组（0.4 μg/ml）CHOP mRNA、GADD34 mRNA表达于复供早期即迅速上升，ODG/R 8 h 达峰值，后期下降；　　 8.Western-blot 免疫印迹分析结果均显示，模型组GRP78、CHOP 蛋白表达随复供时间延长呈上升趋势，治疗组（0.4 μg/ml）GRP78 蛋白表达进一步增加（各时间点均高于模型组），CHOP 蛋白表2?华中科技大学博士学位论文达则在复供早期迅速上升，达峰值后降至模型组水平以下。　　 结论:　　 1.体外模拟缺血再灌注（OGD/R）损伤可诱导大鼠皮质神经元发生细胞凋亡；　　 2.内质网凋亡通路是缺血再灌注损伤后神经元死亡的病理机制之一；　　 3.Exendin-4 可缓和内质网应激，进而抑制损伤后神经元凋亡的发生；　　 4.Exendin-4 神经保护机制可能是通过干预 UPR 通路，加强 PSI 负反馈环路实现的。