目的：近年来,社会生存环境和生活模式不断发生变化,人们生活压力的日益增大,工作节奏不断加快,各种社会应激加剧,长期慢性心理应激作用下导致的机体生物化学功能失常的相关性疾病发病日益增多,慢性心理应激损伤已成为威胁人们身心健康的超级隐患,慢性心理应激相关疾病已成为生物学研究界的重要课题。细胞自噬是近年来细胞生物学领域的研究热点,作为细胞生存的一种自我保护机制,在很多生理过程如降解异常折叠蛋白,清除损伤、衰老细胞器等发挥重要作用。自噬过度或者障碍造成的细胞损伤或诱导的程序性细胞死亡在肿瘤、神经退行性病变、心血管系统疾病、微生物感染、衰老等细胞增殖和凋亡发生紊乱的疾病过程中发挥着重要作用。从慢性心理应激的研究中发现,细胞自噬与慢性心理应激有着密切联系,慢性心理应激损伤可导致细胞自噬过度激活,细胞自噬行为的改变是慢性心理应激损伤的一种重要机制。目前,有关慢性心理应激激发细胞自噬的具体机制尚不十分清楚。慢性心理应激损伤属于中医情志内伤病因的范畴,中医藏象理论认为,肝主疏泄调畅气机对于调节人体的情志活动具有重要意义。因此,从细胞自噬角度研究慢性心理应激损伤的机制对于丰富中医肝藏象及情志病因理论,探索调肝方药防治慢性心理应激损伤相关疾病的作用机制具有重大意义。方法：以8周龄SD成年大鼠为研究对象,采用慢性多相性应激(电击、夹尾、禁食、束缚、禁水、冰水游泳)建立慢性心理应激大鼠模型。观察调肝治法对慢性心理应激大鼠的空间探索、学习记忆能力及焦虑情绪的影响；调肝治法对慢性心理应激大鼠海马CA1区神经细胞自噬体的影响；调肝治法对慢性心理应激大鼠的海马神经细胞及肝细胞自噬相关信号蛋白表达的影响。结果：1、调肝治法对慢性心理应激大鼠的空间学习记忆能力和焦虑情绪的影响1.1体重各组大鼠体重实验前未见差异(P>0.05),在实验过程中体重均有不同程度的增长,造模30天当中,空白组大鼠体重增长最快,慢性心理应激模型大鼠体重增长相对缓慢,应激加加减逍遥散组体重增长最缓慢,应激加自拟方高剂量组体重增长相对其他应激组增长要快。经统计分析造模后各组大鼠体重,与空白组相比较：应激组、应激加自拟方低剂量组、应激加加减逍遥散组、应激加自拟方高剂量组有显著差异(P<0.01),体重比空白组要轻；与应激组相比：空白组、应激加加减逍遥散组和应激加自拟方低剂组和应激加自拟方高剂组未见差异(P>0.05),应激各组大鼠体重相似。1.2旷场实验各组大鼠实验前旷场实验运动总路程未见差异(P>0.05),造模后大鼠运动总路程,应激组、应激加自拟方低剂量组与空白组有显著差异(P<0.01),与空白组相比明显要短；应激加加减逍遥散组、应激加自拟方高剂量组与空白组未见差异(P>0.05),总路程与空白组接近。与应激组相比,空白组和应激加自拟方高剂组有显著差异(P<0.01),比应激组大鼠运动总路程明显要长；与应激加加减逍遥散组比较,应激组有差异(P<0.05),比应激组大鼠运动总路程长；与应激加自拟方低剂组未见差异(P>0.05),两组数值接近。造模前,大鼠中央区运动路程没有明显规律,且样本差异大,离散度大,应激组运动路程最长,但统计分析无差异。造模结束后,空白组与应激组比较有差异(P<0.01),空白组大鼠比应激组大鼠要长,与其他组数值比较接近,未见差异(P>0.05)。1.3Morris水迷宫实验各组大鼠在实验过程中逃避潜伏期不断缩短,造模后水迷宫实验第1天各组大鼠平均潜伏期未见明显差异(P>0.05)。造模后第2天与空白组相比较,应激组大鼠平均潜伏期明显延长(P<0.05),应激加自拟方低剂量组大鼠也明显延长(P<0.01)。造模后第3天与空白组相比较,应激组和应激加自拟方低剂量组平均潜伏期明显延长(P<0.01)；与应激组比较,空白组和应激加加减逍遥散组与应激组大鼠有明显差异(P<0.01)。造模后第4天与空白组相比较,应激组大鼠平均潜伏期明显延长(P<0.01),应激加自拟方高剂量组大鼠平均潜伏期延长(P<0.05)；与应激组比较,空白组、应激加加减逍遥散组和应激加自拟方低剂量组与应激组大鼠有明显差异(P<0.01)。造模后第5天与空白组相比较,应激组大鼠平均潜伏期明显延长(P<0.05)；与应激组比较,应激加加减逍遥散组与应激组大鼠有明显差异(P<0.01)。造模后第6天进行空间探索实验测定停留在平台所在象限时间,与空白组相比,应激组停留平台所在象限时间缩短(P<0.01),其它组与空白组较接近；与应激组相比,空白组与药物组停留平台所在象限时间明显要长(P<0.01)。其120s内穿越平台次数与空白组相比,应激组和应激加自拟方高剂量组穿越次数少(P<0.05)；与应激加加减逍遥散组相比,应激加自拟方高剂量组与应激组穿越次数少(P<0.05)。2、调肝治法对慢性心理应激大鼠海马CA1区自噬体的影响各组大鼠行为学实验结束后取材进行透射电镜观察,比较海马神经细胞内亚细胞结构,空白组大鼠海马CA1区神经细胞完整,未见肿胀坏死,细胞器形态清晰,染色质结构正常,可见少量自噬体；应激组细胞器肿胀,可见很多双层膜包裹结构的自噬体,胞质模糊不清,内含诸多带降解产物,核内染色体弥散,边界不清；应激加加减逍遥散组大鼠细胞核结构完整,细胞器形态清晰,染色质结构正常,可见多个纹理清晰的自噬体；应激加自拟方低剂量组大鼠细胞核结构完整,细胞器形态清晰,染色质结构正常,可见纹理清晰的自噬体；应激加自拟方高剂量组大鼠细胞有肿胀,细胞器形态不清晰,染色质结构模糊,可见少量染色体弥散和固缩的自噬体。与空白组相比较,应激组大鼠海马CA1区自噬体数目明显增多,具有极显著差异(P<0.01),而空白组与应激加加减逍遥散组、应激加自拟方低剂量组及应激加自拟方高剂量则未见明显差异(P>0.05)。与应激组比较,空白组、应激加自拟方低剂量和应激加自拟方高剂量组海马神经内自噬体明显减少,统计学上具有明显极显著性差异(P<0.01),应激加加减逍遥散组也明显减少,具有显著性差异(P<0.05)。3、调肝治法对慢性心理应激大鼠的细胞自噬相关指标表达的影响3.1慢性心理应激大鼠TSC2的阳性表达率肝细胞中TSC2的表达：与空白组相比,应激组大鼠的肝细胞中TSC2阳性表达率明显升高,具有明显性差异(P<0.01)；与应激组比较,其它组肝细胞中TSC2的阳性表达率有明显差异(P<0.01),应激组阳性表达率最高。海马CA1区的神经细胞中TSC2的表达：应激加加减逍遥散组海马CA1区的神经细胞中TSC2阳性表达最少,空白组阳性表达率明显要少,与应激组阳性表达率有显著性差异(P<0.01)；与应激组比较,其它组海马CA1区的神经细胞中TSC2的阳性表达率偏少,应激组阳性表达率最高统计学具有显著性差异(P<0.01)。3.2慢性心理应激大鼠ULK1的阳性表达率肝细胞中ULK1的表达,与空白组相比较,应激组大鼠的肝细胞中ULK1阳性表达率明显升高,具有明显性差异(P<0.01)；与应激组比较,其它组肝细胞中ULK1的阳性表达率偏低,应激组阳性表达率最高,统计学具有显著性差异(P<0.01)。海马CA1区的神经细胞中ULK1的表达：空白组海马CA1区的神经细胞中ULK1阳性表达率最少,与应激组阳性表达率有明显差异(P<0.01),应激加加减逍遥散组偏高,与空白组比较有差异(P<0.05)；与应激组比较,应激加自拟方低剂量组和应激加自拟方高剂量组大鼠海马CA1区的神经细胞中ULK1的阳性表达率有差异(P<0.05),应激组阳性表达率最高。结论：1、调肝治法对慢性心理应激大鼠的空间学习记忆能力和焦虑情绪的影响1.1体重慢性心理应激会影响大鼠体重正常增长,导致大鼠体重降低,影响大鼠正常生长发育,而加减逍遥散散和自拟方不能增加大鼠体重,也不能明显改善慢性心理应激对大鼠生长发育期间的受到的损伤,且加减逍遥散抑制大鼠体重增长更明显。1.2旷场实验慢性心理应激能导致大鼠兴奋性降低,并随之产生焦虑情绪,而这种兴奋性降低和焦虑情绪的产生是部分可逆的,加减逍遥散散和自拟方能适当提高慢性心理应激大鼠兴奋性,且加减逍遥散和自拟方低剂量效果较佳。1.3空间学习记忆实验说明慢性应激能持续损伤大鼠空间学习记忆能力和记忆持久能力,而这种对空间学习记忆能力和记忆力保持能力的损伤是可逆的,加减逍遥散散和自拟方药物都能修复慢性心理应激造成的大鼠空间学习记忆能力和记忆力保持能力的损伤,其中加减逍遥散和自拟方低剂量药物效果最佳。2、调肝治法对慢性心理应激大鼠海马CA1区自噬体的影响慢性心理应激能过度激活海马CA1区神经细胞自噬,而这种细胞自噬导致的损伤是可逆的,加减逍遥散散和自拟方都能抑制慢性心理应激导致的过度细胞自噬的损伤,且自拟方药物效果优于加减逍遥散,且自拟方高剂量药物效果最佳。3、调肝治法对慢性心理应激大鼠的细胞自噬相关指标表达的影响3.1慢性心理应激大鼠TSC2的阳性表达率慢性心理应激可导致大鼠肝细胞和海马CA1区神经细胞自噬的过分激活,而加减逍遥散和自拟方可以通过抑制TSC2的表达以抑制其自噬过分激活,使其处于稳态,维持机体内环境稳定。3.2慢性心理应激大鼠ULK1的阳性表达率慢性心理应激可过度激活肝细胞和海马CA1区神经细胞自噬,加减逍遥散能明显抑制肝细胞中ULK1的表达,但抑制海马CA1区神经细胞中ULK1活性的作用不明显,而自拟方药物可以通过抑制ULK1的表达同时抑制大鼠肝细胞和海马CA1区神经细胞的过度自噬。