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目的研究Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其与患者临床特征的关系。探讨NLK与肿瘤进展的相关性,阐明其在NSCLC发生发展中的作用。方法1.采用Western blot(WB)技术检测8例NSCLC患者癌及癌旁新鲜冰冻组织中NLK、PCNA和GAPDH的表达情况;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)方法检测83例NSCLC患者石蜡组织切片中NLK和增殖指标Ki-67的表达情况,并结合NSCLC患者临床病理资料分析NLK与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤分级、临床分期、淋巴结转移及Ki-67等因素的关系,通过COX回归分析NLK、患者的临床特征与预后的关系。2.采用血清饥饿释放同步化处理肺腺癌A549细胞,用流式细胞仪检测A549细胞周期的变化,WB技术检测在此过程中NLK、cyclin A和PCNA的表达变化。干扰了NLK的慢病毒分别感染A549腺癌细胞和SK-MES-1鳞癌细胞,利用WB技术检测在此过程中NLK、cyclin A和PCNA的表达变化;利用流式细胞术检测细胞周期变化,CCK-8实验检测细胞活性。用克隆形成实验检测NLK对A549细胞的增殖能力的影响。为明确NLK对NSCLC细胞增殖影响的具体机制,本实验利用荧光素酶报告基因实验,在A549细胞中检测干扰NLK后Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的转录活性,并通过WB技术检测下游基因c-myc和cyclin D1的表达。结果1.WB及IHC实验分析显示,NLK在NSCLC癌组织中的表达低于相应的癌旁组织,而PCNA在NSCLC癌组织中的表达高于相应的癌旁组织。NLK的表达强度与NSCLC组织学分级(P=0.002)﹑临床分期(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.015)和Ki-67(P<0.001)具有相关性。COX回归分析显示临床分期(P<0.001)、组织分级(P<0.001)、NLK表达(P=0.023)和Ki-67表达(P=0.025)均能判断NSCLC患者的预后。2.血清饥饿造成A549细胞生长周期停滞,血清释放后刺激A549细胞增殖,NLK蛋白表达降低,细胞周期蛋白cyclin A和PCNA表达增高。A549和SK-MES-1细胞感染干扰了NLK表达的慢病毒后,细胞的增殖被抑制。荧光素酶报告基因实验提示在A549细胞中,NLK可以抑制β-catenin的转录活性,抑制NLK的表达后Wnt/β-catenin信号通路下游基因c-myc和cyclin D1的蛋白表达增高。结论1.在组织学水平,NLK在癌组织中低表达,且与肿瘤的恶性程度和增殖指标Ki-67呈负相关;在NSCLC中,NLK表达高的患者预后比表达低的患者预后好。提示NLK参与了NSCLC的发生发展。2.在细胞学水平,感染包装有NLK-sh RNA的慢病毒后A549及SK-MES-1细胞的生长和细胞周期进程明显加速,表明NLK可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖能力。A549细胞中NLK可能通过Wnt信号通路负性调节β-catenin的转录活性,同时能降低下游分子c-myc及cyclin D1的蛋白表达,从而抑制细胞的增殖,调控NSCLC的发生与发展。