论文部分内容阅读
鹅细小病毒(Goose Provirus，GPV)可引起雏鹅、雏番鸭高度致死性传染病—小鹅瘟。该病以消化道，尤其是小肠部位典型纤维性栓塞病变为特征。我国学者方定一于1961年首次分离到该病的病原体。目前我国仍有小鹅瘟的流行，给一些地区的养鹅业造成巨大的经济损失。 GPV是细小病毒科、细小病毒属成员，属自主复制型细小病毒。病毒基因组为单股、线性DNA，核苷酸序列长约5.1kb，含有两个开放阅读框架(ORF)，右侧ORF(RORF)编码3种结构蛋白(VP)，即VP1、VP2、VP3；左侧ORF(LORF)编码非结构蛋白NS1和NS2，主要参与病毒DNA的复制及调节基因的表达。GPV与依赖病毒属成员AAV-2及红病毒属成员人细小病毒B19的进化关系较近。因为GPV同AAV-2一样，感染细胞后生命周期的许多方面都与非结构蛋白的调节有关，所以有必要对GPV非结构蛋白的分子生物学特性进行研究。 本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因序列，借助Oligo4.1软件设计一对引物，采用PCR技术扩增GPV H1株非结构蛋白NS2基因，并与pMD18-T载体连接后测序，结果表明：鹅细小病毒H1株NS2基因核苷酸全长1356bp，编码451个氨基酸残基，与GPVB株的NS2基因相比，核苷酸数目相同，有17个碱基、6个氨基酸的差异；同源性分析表明：二者核苷酸序列同源性为98.75％，推导氨基酸序列同源性为98.67％。 将NS2基因插入到原核表达性质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ多克隆位点之间，将重组原核表达质粒pGEX-6P-NS2转化到BL21(DE3)plysS感受态细胞中，获得了表达NS2基因的阳性亚克隆重组子，在含Amp的LB液体培养基中培养，经IPTG诱导表达，用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明：NS2基因在原核表达细菌BL21(DE3)plysS中获得高效表达，表达产物约75ku的GST-NS2融合蛋白，表达量达菌体总蛋白的30.1％。 本试验为进一步研究GPV的分子生物学特性、NS2蛋白的理化特性及生物学活性奠定了基础，为确立GPV的分类地位及其进化关系提供了依据，同时为研制GPV诊断试剂做了前期工作。