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裂殖壶菌（Schizochytrium）是一种可在细胞内合成超长碳链脂肪酸的单细胞异养微藻。人们通过诱变筛选以及发酵优化等手段,实现了其高密度工业化生产。本实验室前期研究发现,裂殖壶菌在发酵后期细胞内脂肪酸发生选择性水解,从而导致DHA富集。为了揭示裂殖壶菌胞内参与脂肪酸水解的关键脂肪酶基因的作用机制,本论文克隆了Schizochytrium sp.S31中的脂肪酶基因STGL2和STGL3,并在毕赤酵母中进行表达,获得重组蛋白,系统分析了裂殖壶菌脂肪酶的酶学性质,为裂殖壶菌的基因工程改造提供了理论依据。首先,本研究在Schizochytrium sp.S31基因组测序的基础上,利用生物信息学手段筛选了两个脂肪酶基因STGL2和STGL3。以裂殖壶菌RNA为模板,反转录得到cDNA片段,再经过PCR扩增得到目的基因。随后将目的基因连接到pPIC9K载体上,获得重组质粒pPIC9K-STGL2和pPIC9K-STGL3。其次,将重组质粒pPIC9K-STGL2和pPIC9K-STGL3转染毕赤酵母SMD1168,筛选得到重组转化子SMD1168/pPIC9K-STGL2和SMD1168/pPIC9K-STGL3。利用脂肪酶活性平板以及高效液相色谱法初步筛选重组酶活性较高的转化子。用SDS-PAGE电泳检测脂肪酶Stgl2p和Stgl3p的表达。课题组前期获得了一株SMD1168/pPIC9K-STGL1转化子。本课题利用摇瓶发酵Stgl1p、Stgl2p和Stgl3p转化子,并通过橄榄油乳化法以及对硝基苯酚法定量分析转化子的脂肪酶活力。结果表明Stgl1p、Stgl2p和Stgl3p脂肪酶活力分别达到8.68 U/mL、10.90 U/m L和5.90 U/mL。最后,纯化重组脂肪酶蛋白。利用截留分子量为10 kDa的半透膜浓缩,再通过HistrapTM Fast Flow亲和柱层析,获得纯化的重组蛋白。对重组脂肪酶Stgl1p、Stgl2p和Stgl3p进行酶学性质研究,结果表明Stgl1p和Stgl3p的最适反应温度均为40oC,Stgl2p最适反应温度则为35oC。Stgl1p最适pH 7.0;而Stgl2p和Stgl3p最适pH条件为7.5,且三种脂肪酶在微碱性的环境中都有良好的稳定性。三种脂肪酶对不同碳链长度的底物特异性不同,其中Stgl2p对C8脂肪酸和C12脂肪酸有较高的选择性,其最适底物为C12脂肪酸;Stgl1p对C8脂肪酸显示出较高特异性,Stgl3p对中长碳链和长碳链(C12、C14和C16)脂肪酸均显示出较好的脂肪酶活性。由实验结果推测发酵后期脂肪酶基因STGL2和STGL3参与裂殖壶菌体内甘三酯的水解。