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第一部分 利用单细胞转录组测序研究川崎病循环单核细胞亚群变化研究背景川崎病（Kawasaki disease,KD）是一种系统性免疫性血管炎,与固有免疫系统的激活有重要关系,单核细胞是固有免疫系统的重要成员,在血管炎的发生中发挥关键作用,然而由于单核细胞具有明显的异质性且功能复杂,导致其在KD中的作用机制仍不明确,我们推测可能存在其他未知的单核细胞亚群调控KD的发生,如在炎症的发生发展及消退过程中特殊种类的单核细胞或细胞因子。scRNA-seq可以在单细胞水平揭示单核细胞的整体转录组特征,分析不同细胞亚群之间的细微差异,进而找到KD中发生变化的单核细胞亚群,有利于寻找更安全有效的治疗靶点。研究目的通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）的方法全面揭示健康及KD婴儿外周血单核细胞单细胞转录组图谱,揭示KD患儿外周血单核细胞亚群特征,并寻找其与健康婴儿单核细胞亚群的差异,旨在寻找KD中发挥关键作用的单核细胞亚群。研究方法:（1）收集2例健康婴儿和2例KD患儿的外周血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,利用免疫磁珠富集单核细胞;（2）对富集得到的单核细胞进行单细胞标记,构建文库进行scRNA-seq;（3）通过无监督聚类得到不同的细胞亚群,通过每亚群细胞的marker基因对不同的亚群进行鉴定;（4）通过对比健康婴儿与KD患儿单核细胞亚群,揭示KD患儿中发生改变的单核细胞亚群;（5）通过对亚群的高表达基因进行功能富集分析,进而推测不同亚群的功能;（6）通过拟时序分析寻找不同细胞亚群之间的分化关系;（7）利用流式细胞仪对KD患儿中发生改变的单核细胞亚群进行蛋白验证。研究结果（1）通过对健康婴儿的单核细胞进行无监督聚类分析,发现3种单核细胞亚群,分别是CD14++CD16-单核细胞（即经典型单核细胞,classical monocyte,CM）、CD14+CD16+单核细胞（即中间型单核细胞,intermediatemonocyte,IM）和CD14+CD16++单核细胞（即非经典型单核细胞,non-classical monocytes,NCM）;（2）通过拟时序分析,发现健康婴儿的3群单核细胞亚群之间存在线性分化关系,CM经过IM分化为NCM;（3）通过功能富集分析,发现健康婴儿的3群单核细胞亚群具有不同的功能,CM主要与对细菌的反应和中性粒细胞的活化相关,IM主要与抗原的处理与提呈、对病毒的反应相关,NCM主要与细胞因子产生、细胞增殖及炎症反应相关;（4）通过对比健康与KD婴儿的单核细胞亚群图谱,发现KD患儿中SELL+CM明显增加,其功能主要与中性粒细胞的活化相关,且分化程度较低;（5）利用KD及健康婴儿的外周血PBMC验证SELL+CM的数量变化,发现KD患儿PBMC中SELL+CM有增高趋势。结论（1）健康婴儿外周血单核细胞分为3种具有不同功能的亚群,且亚群之间存在分化关系。（2）健康与KD婴儿外周血单核细胞亚群图谱不同,KD患儿外周血SELL+CM含量增高,此亚群与中性粒细胞的活化相关。第二部分 利用单细胞转录组测序研究川崎病外周血单个核细胞亚群变化研究背景虽然KD的发病机制仍不清楚,但是已经发现免疫系统的激活在KD发生中发挥至关重要的作用。研究发现外周血免疫细胞的数量及表型均发生不同的变化,然而至今仍未找到导致KD发生的关键细胞或分子,可能是由于机体的免疫细胞极具多样性且免疫系统作为一个整体发挥作用,而之前的研究方法主要集中于单个细胞种类的研究,很难对免疫系统进行整体全面的研究,导致KD发生中起关键调控作用的免疫细胞亚群或分子被忽略。scRNA-seq可以在单细胞水平揭示免疫细胞的整体转录组特征,在免疫系统整体水平分析不同免疫细胞亚群之间的相互作用,找到发挥关键作用的免疫细胞亚群,有助于阐明KD的免疫学发病机制。研究目的通过scRNA-seq全面揭示健康及KD儿童PBMC单细胞转录组图谱,揭示KD患儿发生变化的细胞亚群及其基因表达特征,分析细胞亚群之间的通讯关系找到发挥关键作用的细胞亚群。研究方法（1）收集3例健康儿童和3例KD患儿的外周血,分离PBMC并保存;（2）对PBMC进行单细胞标记,构建文库进行scRNA-seq;（3）通过无监督聚类得到PBMC不同的细胞亚群,通过分析亚群细胞的marker基因对各亚群进行鉴定;（4）通过对比KD与健康儿童PBMC亚群,揭示KD患儿发生改变的细胞亚群,分析其高表达基因,并对高表达基因进行功能富集分析,揭示KD发生改变的细胞亚群的功能;（5）利用CellPhoneDB软件分别对KD和健康儿童的PBMC各亚群进行细胞通讯网络分析,分析KD和健康儿童之间细胞亚群通讯网络的不同,并揭示关键细胞亚群之间的配体受体对。研究结果（1）通过对3例KD患儿与3例健康儿童的72857个PBMC进行scRNA-seq,经过无监督聚类分为32个细胞亚群,其中包括20个T细胞亚群、3个B细胞亚群、3个NK细胞亚群、5个髓系细胞亚群和1个内皮祖细胞亚群;（2）通过分析每个PBMC亚群在所有PBMC亚群中的比例,比较KD与健康儿童之间是否存在比例上的差异,发现经典B细胞亚群和CD3E+B细胞亚群在KD患儿明显增加,而COTL1+NK细胞亚群在KD患儿明显减少;（3）通过功能富集分析,发现经典B细胞亚群在KD高表达基因主要与吞噬体相关,而CD3E+B细胞亚群在KD高表达基因主要与PI3K-Akt信号通路和细胞对IL-4的反应相关,COTL1+NK细胞亚群在KD患儿高表达的基因主要与胞吐、Fc受体信号通路及细胞因子信号通路相关;（4）分别对KD和健康儿童的32个PBMC亚群进行细胞间通讯网络分析,发现KD和健康儿童均以FCGR3A+CSF1R+髓系细胞为中心,健康儿童和KD患儿的FCGR3A+CSF1R+髓系细胞关联最强的4个细胞亚群不同,KD患儿FCGR3A+CSF1R+髓系细胞与COTL1+NK细胞关联较强,其受体配体对CD74-MIF和CD74-COPA表达量最高且富集最显著。结论（1）首次揭示了 KD与健康儿童PBMC单细胞转录组图谱;（2）KD患儿中2个B细胞亚群占比增高,1个NK细胞亚群占比明显减低;（3）KD患儿FCGR3A+CSF1R+髓系细胞和COTL1+NK细胞存在较强的通讯关系,2个细胞亚群之间受体配体对CD74-MIF和CD74-COPA发挥重要作用。