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红曲色素（Monascus pigments,MPs）是由红曲菌（Monascus spp.）产生的一类重要次级代谢产物,主要是红、橙、黄等3类色素组成的混合物,在我国及东南亚国家已有上千年的使用历史。目前,已经鉴定的MPs成分多达90种,但其生物合成途径仍存在争议。研究发现,MPs的生物合成是由基因簇调控的,因此分析MPs基因簇中相关基因敲除子或异源表达子的代谢产物,是揭示MPs基因功能,探讨其合成途径的重要内容。本研究以原始菌株红色红曲菌（M.ruber）M-7,11株MPs相关基因敲除子——△pig A、△pig B、△pig C、△pig D、△pig E、△fasα、△fasβ、△pks10、△fmds、△fao、ISM,3株MPs相关基因的米曲霉（Aspergillus oryzae,M-2-3）异源表达子——A.oryzae-A、A.oryzae-A-O/N、A.oryzae-A-O/N-D,以及2株pig A基因酰基载体蛋白（Acyl carried proteins,ACP）结构域的突变子—A.oryzae-ACP1、A.oryzae-ACP2,共17株菌株为材料,建立了MPs的高效液相（High performance liquid chromatography,HPLC）分析方法,通过光谱和质谱等鉴定了这些突变子的主要MPs成分,并对它们的MPs种类进行了比较。在此基础上,结合基因功能预测和饲养试验,推测了MPs可能的生物合成途径。主要研究结果如下:1.MPs的HPLC分析条件建立红曲菌M-7及其色素敲除子和异源表达子的MPs种类繁多,结构复杂,因此建立统一高效的HPLC检测方法是分析MPs的重要前提。本试验以弱极性色素组分较多的原始菌株M-7和极性色素组分较多的敲除子△fasα为代表材料,分别制备红曲米,采用甲醇为提取剂,按固液比1:5（g/m L）充分混匀,超声提取30 min,取上清,12 000 r/min离心10 min,上清液稀释300倍,过0.22μm膜,进样10μL,以Inertsil ODS-3为色谱柱,流速为0.8 m L/min,柱温为25℃,PDA检测器的检测波长（nm）为520、470、380和360,建立了适用于弱极性和强极性MPs组分HPLC分离与分析的梯度洗脱方法,分别称为G1和G2。进一步分析表明,M-7、△pks10、△fmds、△fao、△pig E红曲米的MPs组分采用G1条件能有效分离;△pig C、△pig D、△fasα、△fasβ、△pig A、△pig B红曲米的MPs和米曲霉异源表达子察氏培养物的MPs组分采用G2条件能很好分开。2.M-7红曲米中色素的分离与鉴定首先以薄层层析色谱（Thin layer chromateography,TLC）分离M-7红曲米中的色素组分。以硅胶G为固定相,甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:1（V/V/V）为展开剂时,分离得到14种色素组分（条带）,根据色素的最大吸收波长（Maximum absorption wavelength,MAW）分为6种红色素（R3-R8）,其MAW为490 nm～530 nm、6种黄色素（R9-R10,Y1-Y2,BF1-BF2）,其MAW为330 nm～450nm和2种橙色素（O1-O2）,其MAW为460 nm～480nm。它们在G1的HPLC条件下出峰时间（Retention time,Rt）分别为（min）:9.223、13.224、7.150、7.494、8.262、12.307、6.892、10.564、16.727、22.201、14.245、19.802、17.499、23.505。收集上述14种色素组分,经质谱和光谱分析表明,除R3（m/z=482）和R4（m/z=510）的结构未知外,其他组分分别为:红色素A（R5）、红色素B（R6）、Rubropunctamine（R7）、Monascorubra Mine（R8）、Monasfluol A（R9）、Monasfluol B（R10）、Monascine（Y1）、Ankaflavin（Y2）、Monasfluore A（BF1）、Monasfluore B（BF2）、Monascorubrin（O1）、Rubropunctatin（O2）。3.M-7色素相关基因敲除子的红曲米和异源表达子察氏培养物中色素的分离与鉴定采用上述TLC、HPLC（G1）和MS分析△pks10、△fmds、△fao红曲米中的MPs。结果表明,3个基因敲除子与原始菌株M-7色素种类相同;在相同的条件下,△pig E产生5种黄色素分别为:FK17-P2b2（YP1,m/z=236）、Monasfluore A（YP2,m/z=356）、Monasfluore B（YP3,m/z=384）、Monascin（YP4,m/z=358）、Ankaflavin（YP5,m/z=386）,其结构前期由实验室人员鉴定,它们的Rt分别为（min）:4.553、13.779、19.459、16.318、21.893;采用上述TLC、HPLC（G2）和MS分析了△pig A、△pig B、△fasα、△fasβ、△pig D、ISM、△pig C红曲米中的MPs组分。结果表明,△pig A和△pig B不产色素;△fasα和△fasβ中主要黄色素组分△fasα-1为Monascusone A（m/z=254）,Rt=10.435min;△pig D主要黄色素（m/z=250）的Rt=9.060 min,结构未见报道;ISM主要组分M7pks-1（m/z=252）的Rt=17.722 min;△pig C中3种主要组分△pig C-1（m/z=248）、△pig C-2（m/z=232）、△pig C-3（m/z=246）的Rt（min）分别为:17.975、21.386、24.620,结构未见文献报道。采用HPLC（G2）和MS分析5株米曲霉异源表达子A.oryzae-A、A.oryzae-A-O/N、A.oryzae-A-O/N-D、A.oryzae-ACP1、A.oryzae-ACP2在28℃培养5 d的察氏培养物（包括菌丝体和培养基）的MPs。经40℃恒温干燥约12 h至恒重后采用甲醇为提取剂,按1:4（g/m L）固液比提取,进样20μL,经LC-MS分析并与△pig C对比发现,A.oryzae-A新增主要代谢产物为△pig C-3,结构未知;A.oryzae-A-O/N新增主要代谢产物为△pig C-2,本实验室前期已鉴定结构;A.oryzae-ACP1、A.oryzae-ACP2和A.oryzae-A-O/N-D均无新增色素组分产生。4.饲养实验监测△pig A重新产生的色素种类前期研究表明,ISM的主要代谢产物M7pks-1可能是MPs合成的前体物质,同时△pig A不产任何MPs组分。将M7pks-1添加至察氏固体培养基中,使其终浓度分别为0.005、0.1、0.5（mg/m L）,28℃培养,采用G1的HPLC条件检测察氏培养基（包括菌丝和培养基）中△pig A产生的MPs组分。将不同终浓度的M7pks-1添加到培养基中28℃培养6 d时,△pig A可产生稳定的MPs组分。结果表明,当M7pks-1的浓度为0.005 mg/m L,△pig A可产生R9、R10、Y1、Y2、BF1和BF2共6种黄色素;当M7pks-1的浓度为0.1 mg/m L和0.5 mg/m L时,△pig A可产生4种黄色素（Y1、Y2,BF1、BF2）,以及4种红色素,其中2种红色素为R7和R8,另外2种是结构未知的红色素（Rt与R9、R10相同）。以△pig A产生稳定色素的M7pks-1最低添加浓度0.1 mg/m L,检测28℃培养不同时间的MPs组分。结果表明,当培养3 d-5 d时,主要生成的是Y1、Y2、BF1和BF2共4种黄色素;而培养至6 d和12 d时,除上述4种黄色素,还生成4种红色素,其中2种红色素为R7和R8,另外2种是结构未知的红色素（Rt与R9、R10相同）。在上述M7pks-1的浓度范围内,无任何橙色素产生。由此说明M7pks-1是色素合成的前体物且黄色素的形成早于红色素。