第一部分:一种改良型小鼠哮喘模型的建立及评价哮喘动物模型一直是哮喘研究的重要手段和工具,也是本研究的重要基础和平台。为此我们选择遗传背景清楚,所需试剂易购价廉的BALB/c小鼠建立哮喘模型。结合文献报道,通过控制实验动物条件、改良致敏剂及致敏方法等,摸索出一种新的、效果良好的小鼠哮喘模型建立方法,为后续研究提供很好的工具和手段。目的:建立一种改良型小鼠哮喘模型并评价其效果。方法: SPF级雌性BALB/c小鼠20只,随机分为模型组和对照组,模型组于第0和14d(腹腔+皮下)注射100μg OVA(卵清蛋白)致敏,第21～30d雾化吸入5% OVA激发,对照组则用生理盐水替代。结果:模型组小鼠在激发过程中出现明显呼吸加深加快,点头呼吸,安静少动,弓背直立,二便失禁等哮喘急性发作表现。BALF(支气管肺泡灌洗液)中白细胞总数及嗜酸性粒细胞分类明显增多。血清及BALF中IL-4明显增高,INF-γ降低,OVA特异性IgE增高。肺组织病理切片见细支气管及伴行血管周围有较多炎症细胞浸润,嗜酸性粒细胞聚集,杯状细胞增生,粘液分泌增加,平滑肌增生肥厚,部分肺泡间隔断裂形成肺气肿。1结论:通过对方法的改良,成功建立小鼠哮喘动物模型,为后续研究提供了很好的工具和手段。第二部分:携带mIL-4RA基因重组载体的构建及在气道上皮细胞株9HTE中的表达IL-4(白细胞介素-4)和IL-13是支气管哮喘发病机理中两个非常重要的细胞因子,他们在维持气道慢性炎症及气道高反应性等众多病理过程中均起着至关重要的作用。和其他许多细胞因子一样,IL-4和IL-13生物学效应的发挥均需通过细胞表面特异性受体来完成。研究发现IL-4和IL-13共用一条受体链,即IL-4Rα链。将鼠IL-4碳末端结构域诱导突变,产生的突变体与IL-4Rα具有很高的亲和力,但是不能诱导后续生物学效应,为一种竞争性拮抗体。由于该拮抗体作用于IL-4和IL-13的共用受体链IL-4Rα,故可同时阻断IL-4和IL-13的生物学功能。将鼠IL-4碳末端118位后的氨基酸完全截去所构建的C118缺失突变体即是这样一种mIL-4RA(鼠白介素4受体拮抗体)。本部分拟构建含mIL-4RA基因和增强型绿色荧光蛋白标记基因的重组真核表达质粒,并检测其在气道上皮细胞株9HTE中的表达,为后续免疫基因治疗奠定基础。目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因标记的mIL-4RA真核表达质粒,并检测其在气道上皮细胞株9HTE中的表达。方法:RT-PCR方法获取mIL-4RA cDNA,亚克隆至pMD-18 T simple质粒中。经测序鉴定后,用PCR方法扩增目的基因,并加上Kozak序列,起始和终止密码,亚克隆至pIRES2-EGFP质粒中,构建含mIL-4RA基因的真核表达质粒pIRES2-EGFP/mIL-4RA。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转染9HTE细胞,通过荧光蛋白的表达实时监测mIL-4RA在9HTE细胞内的表达,并用ELISA方法进行定量。结果:经核苷酸序列测定及PCR方法,鉴定成功获得含mIL-4RA基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/mIL-4RA。通过荧光倒置显微镜观察到质粒转染后6小时即有荧光蛋白表达,荧光强度在转染后48小时达高峰。ELISA方法检测到mIL-4RA重组质粒转染9HTE细胞培养上清中mIL-4RA表达量为30.6±8.2pg/ml,而空质粒转染9HTE细胞培养上清中mIL-4RA表达量为2.5±1.2pg/ml,两者相比差异有统计学意义。结论:本部分成功构建含mIL-4RA基因的重组真核表达质粒,且该质粒可在气道上皮细胞株9HTE中成功表达mIL-4RA蛋白,为后续免疫基因治疗提供了重要前提和基础。第三部分:气管内滴注mIL-4RA重组载体对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用支气管哮喘是儿科常见病、多发病,治疗目前主要为气道局部吸入皮质激素,但仍有不少患儿治疗效果不理想,因此有必要继续寻求新的治疗方案。研究表明Th2类细胞因子所诱导的免疫反应在哮喘发生、发展及转归中均起着十分重要的作用,这其中又以IL-4和IL-13的作用为甚,因此很多学者均将其二者列为哮喘治疗的重要靶目标。但由于IL-4和IL-13在哮喘中的作用有交叉,但又各自承担着不同的生物学功能,因此单独针对IL-4或IL-13的治疗往往难以收到十分满意的效果。在论文第二部分我们成功构建了一种含mIL-4RA(C118 deletion)的真核表达质粒,由于该mIL-4RA作用于IL-4和IL-13的共用受体链IL-4Rα,故可同时阻断IL-4和IL-13两者的生物学功能,具有很好的应用前景。本部分拟通过气道局部干预途径,即气管内滴注方式,观察该mIL-4RA对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的治疗效应。目的:通过气管内滴注mIL-4RA的真核表达质粒,观察对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用。方法:SPF级BALB/c小鼠48只,随机分为正常对照组、哮喘模型组、mIL-4RA质粒干预组和空质粒对照组。哮喘模型组用OVA致敏和激发(方法同第一部分);正常对照组用生理盐水替代;mIL-4RA质粒干预组于第一次致敏当天,气管内滴注mIL-4RA真核表达质粒10μg,余处理同模型组;空质粒对照组于第一次致敏当天,气管内滴注空pIRES2-EGFP质粒10μg,余处理同模型组。观察小鼠的哮喘发作情况,肺组织病理切片检测肺部病理损害,支气管肺泡灌洗检测BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞分类,ELISA方法检测BALF及血清中Th1,Th2类细胞因子水平,免疫组化法检测肺组织原位Th1,Th2类细胞因子水平,免疫荧光法检测肺组织磷酸化-STAT6的水平,流式细胞术检测外周血、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值。结果:与空质粒对照小鼠比较,气管内滴注mIL-4RA真核表达质粒可明显减轻小鼠的急性哮喘发作症状;减轻气道炎症和嗜酸性粒细胞浸润;减轻肺部病理损害;降低气道局部Th2类细胞因子IL-13的水平(p<0.01),增加气道局部Th1类细胞因子INF-γ的水平(p<0.01);下调血清中IL-13的水平(p<0.01),但对血清中INF-γ的水平没有明显调节作用(p>0.05);可降低肺组织磷酸化-STAT6水平;气管内滴注mIL-4RA真核表达质粒对哮喘小鼠外周血、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值没有明显影响(p>0.05)。结论:气管内滴注mIL-4RA真核表达质粒可明显减轻小鼠急性哮喘发作症状,减轻肺部炎症和嗜酸性粒细胞浸润;调节气道局部Th失衡,但对于体液Th失衡调节作用有限;可降低肺组织Th2类转录因子STAT6磷酸化水平;但对哮喘小鼠外周血、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值均没有明显影响。第四部分:腹腔注射mIL-4RA重组载体对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用前一部分研究中我们通过气道局部干预途径,即气管内直接滴注的方式,观察到mIL-4RA真核表达质粒对哮喘小鼠具有很好的治疗作用,但气管内滴注毕竟属有创性治疗,存在需要实验条件高,有较大的风险性,不易反复进行等缺点,这势必大大限制其在动物实验及进一步临床研究中的实际应用价值。因此在本部分研究中,我们改干预方式为另一种实用价值更高的简单易行的方法即腹腔注射,观察腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用,并比较两种不同干预途径对哮喘小鼠的治疗效果及特点。目的:通过腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒,观察对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用。方法:SPF级BALB/c小鼠48只,随机分为正常对照组、哮喘模型组、mIL-4RA质粒干预组和空质粒对照组。哮喘模型组用OVA致敏和激发(方法同第一部分);正常对照组用生理盐水替代;mIL-4RA重组质粒干预组分别于第一次和第二次致敏当天,腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒各50μg,余处理同模型组;空质粒对照组于第一次和第二次致敏当天,腹腔注射空pIRES2-EGFP质粒各50μg,余处理同模型组。观察小鼠的哮喘发作情况,肺组织病理切片检测肺部病理损害,支气管肺泡灌洗检测BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞分类,ELISA方法检测BALF及血清中Th1,Th2类细胞因子水平,免疫组化法检测肺组织原位Th1,Th2类细胞因子水平,免疫荧光法检测肺组织局部磷酸化-STAT6水平,流式细胞术检测外周血、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值。结果:与空质粒对照小鼠比较,腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒亦可明显减轻小鼠急性哮喘发作症状;减轻肺部炎症和嗜酸性粒细胞浸润;减轻肺部病理损害;不但可降低气道局部Th2类细胞因子IL-13的水平(p<0.01),增加Th1类细胞因子INF-γ的水平(p<0.01);而且可下调血清中IL-13的水平(p<0.01),增加血清中INF-γ的水平(p<0.01);可降低肺组织磷酸化-STAT6的水平;同样腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒对哮喘小鼠外周血、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值均没有明显影响(p>0.05)。结论:腹腔注射mIL-4RA真核表达质粒亦可明显减轻小鼠哮喘急性发作症状;减轻肺部病理损害和炎症;减轻气道嗜酸性粒细胞浸润;调节气道局部和体液Th失衡;可降低肺组织磷酸化-STAT6水平;但对哮喘小鼠PBMC、肺及脾脏中CD3+CD4+TL细胞和CD3+CD8+TL细胞比值同样没有明显影响。