论文部分内容阅读
精确的细胞周期调控影响着机体内各种重要的生物学过程，而细胞周期调控的异常则可能导致增殖性疾病，最典型的就是肿瘤。恶性肿瘤最大的特点就是细胞生长和增殖的无休止性、不可调控性。从分子水平上对人类肿瘤和相关动物模型的分析，为认识和理解正常细胞和肿瘤细胞内控制细胞周期进程的复杂机制奠定了基础。研究发现，许多与细胞周期的进入和不断推进有关的调控因子在肿瘤中发生了改变。这种变化主要发生在两类基因中，即癌基因和抑癌基因。癌基因的激活可以促进肿瘤生长，而抑癌基因（如pRb和p53）的失活可以使正常情况下抑制细胞周期进程的蛋白功能紊乱，同样也促进肿瘤生长。肿瘤相关的细胞周期紊乱主要是由于其中的某些蛋白发生突变而引起的。在肿瘤中，已经证实突变可以发生在编码各种细胞周期相关蛋白的基因上。事实上，大多数的人类肿瘤均表现为G1期进程调控的异常，而这将决定细胞是发生增殖还是处于静息状态。近年来，细胞周期的研究已经成为生命科学研究领域关注的一大热点。因此，阐明肿瘤细胞周期调控和检测点异常的具体机制，掌控这一复杂的调控机制将有助于发现新的治疗策略。
细胞周期调控机制的研究往往需要大量同步化生长的细胞，因此高效的同步化方法有助于细胞周期的研究。最常用的同步化方法包括了选择同步化（如洗脱离心法和有丝分裂选择法）和诱导同步化（如胸苷双阻断法、血清饥饿法和其他药物诱导法）。当然，要想在同步化细胞内检测某些分子活性的周期性变化，良好的同步化效果是必需的。同步化方法的敏感性则完全取决于所选择细胞的同步化程度。由于具有良好的同步化效果，人宫颈癌HeLa细胞被广泛用于细胞周期的研究。已往研究证明，采用过量的胸苷诱导细胞同步化是最早被广泛应用的一种方法，在今天看来它依然是最有效而便捷的。采用胸苷连续两次阻断，获得的细胞基本上被阻断在G1/S交界处，释放后细胞以相同的速率完成细胞周期。因此，本研究中采用这种方法来同步化HeLa细胞。
microRNA是一类21～25 nt的非编码小分子RNAs，它们通过靶向mRNA的3-非编码区（3UTR），抑制蛋白的翻译或降解靶基因mRNA，实现调控基因表达的功能。首先，RNA聚合酶Ⅱ转录产生带有茎环结构的初级miRNA转录产物（pri-miRNAs）。在核内，转录产物通过加帽、多聚腺苷酸化，并进一步经Drosha（RNaseⅢ蛋白家族一成员）和Pasha/DGCR8形成的复合体识别和切割，形成具有发夹结构的长度约60～75 nt的前体miRNA（pre-miRNAs）。在exportin-5的介导下，前体miRNA从细胞核内被转运至细胞质中，另一种位于细胞质内的RNaseⅢ酶——Dicer识别并切割其特征性发夹结构，形成约22 nt的双链成熟的miRNA。随后这种双链复合物整合到一种被称为miRNA诱导沉默复合物（miRNA-induced silencing complex，miRISC）中，成熟的miRNA被优先保留在具有功能的复合物中，对靶基因进行识别。显而易见，这种调控机制能使单个miRNAs靶向大量的转录本，从而协同调控基因表达的复杂过程，实现对细胞功能的影响。
目前，已经在许多生物体内发现了大量的miRNAs及其靶基因。最近公布的miRBase（12．0版）数据库对695种miRNA在人类基因组中的定位进行了注释。生物信息学分析预测miRNAs可能在人体内调控超过30%的编码基因，miRNAs及其靶基因共同组成了复杂的调控网络。每种miRNA能抑制上百个靶基因，相反，每个mRNA又可能受到多种miRNAs的调控。生物信息学和实验技术相结合的综合分析方法在确定miRNAs靶基因的工作中发挥着相当重要的作用。
肿瘤发生往往伴随着细胞周期调控的紊乱，但是细胞内miRNA的差异表达对细胞周期调控机制的影响究竟有多大，尚需进一步研究。越来越多的证据提示，一些miRNAs的靶基因所编码的蛋白与细胞周期进程和细胞增殖直接或间接相关。miRNAs通过直接靶向E2F、Cdks、cyclins、CKI等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控经典的细胞周期信号通路。而且从最近的一些研究获悉，miRNAs本身也可能受到细胞周期的调控。综上所述，上述研究充分说明深入探讨那些受到miRNAs调控的细胞内信号通路诠释了一个新的研究领域，这将有助于加深我们对经典的细胞周期调控机制的认识和理解，也将为我们理解miRNA的异常表达与肿瘤细胞增殖和存活的关系提供新思路、新线索。
假设miRNAs能够调控那些在细胞周期运行过程中协同表达的基因，那么就很可能存在着依赖于细胞周期的调控机制对miRNAs的活性进行调节，从而使得某些特异性的miRNAs的表达也存在周期性的变化。因此，研究不同周期时相间miRNAs表达谱的变化将为我们理解依赖于miRNAs的细胞周期调控模式提供新的线索。本研究以胸苷双阻断法获得同步化的HeLa细胞，利用芯片技术对不同周期时相的HeLa细胞中的miRNA表达谱的变化进行研究，结合生物信息学的方法筛选差异表达的miRNAs分子，并对其表达模式进行归类。从miRNA组学水平上对HeLa细胞内周期特异性的miRNA表达谱进行系统而全面的研究，将有助于我们更好地理解miRNAs在肿瘤发生和细胞周期调控中所起的作用。同时，也将为miRNAs协同其他细胞因子共同参与细胞周期调控的观点提供了重要实验依据，这是一种全新的细胞周期调控机制，是对经典的细胞周期调控机制的重要补充。
本研究主要分为以下三方面：
第一部分：胸苷双阻断法诱导HeLa细胞同步化的研究。此法能将HeLa细胞阻断于G1/S交界处，同步化实验中需先后两次加入2 mM的胸苷以阻断HeLa细胞。在二次阻断释放后不同时间点收集细胞，并采用PI染色在流式细胞仪上进行细胞周期的检测。结果发现，非同步化生长的细胞中G1、S、G2/M期的细胞分别占57．45±3．76%、16．76±1．32%、25．79±3．64%。阻断释放时，几乎所有的细胞都停留在G1/S交界处。根据细胞DNA含量分析和各个周期时相细胞所占的实际比例可以确定二次阻断释放后，细胞被有效地同步化于G1/S交界处。细胞周期分析的结果表明，约80%的细胞在去除胸苷后4h进入S期，细胞于6～10 h开始进入G2/M期，再次进入G1期的时间大约在12～16 h之间，10 h和16 h分别得到的G2/M、G1期的细胞数量最多。综上所述，胸苷双阻断法可以有效地获的同步化生长的HeLa细胞，可用于细胞周期的研究。
第二部分：应用Chipscreen的人类microRNA芯片系统研究HeLa细胞中具有细胞周期依赖性的差异表达miRNAs。分别从同步化于G1（16 h）、S（4 h）和G2/M（10h）期的HeLa细胞中提取总RNA。随后，将多聚腺苷酸尾巴添加至上述样品中富集的miRNAs分子中，加尾后的miRNAs再通过Ambion mirVanaTM miRNA标记试剂盒进行Cy3单色荧光标记。对标记好的样品进行纯化，与采用Invitrogen公司的NCodeTM人类miRNA探针文库点制的miRNA芯片于37℃杂交18 h。芯片洗涤干燥后在GenerationⅢ芯片扫描仪进行扫描。原始数据按照如下步骤进行预处理：首先从探针的荧光信号中扣除背景信号，随后按照Huber的方法进行变量稳定性处理和综合计算；对重复点样的探针的数据进行合并取平均数，保留698种人类成熟miRNAs的数据。接着，采用SAM软件（Significant Analysis of Microarray）中的Multiclass算法和Limma中1mFit/eBayes算法对细胞周期特异性表达的miRNAs进行富集。最后，采用Genecluster2．0软件对差异表达的miRNAs进行自组织图（Self-Organize Mapping，SOM）分析，根据表达模式的不同，可将25个miRNAs分成5组。
第三部分：应用实时荧光定量RT-PCR法对芯片筛选出的4个时相性差异表达的miRNAs和2个稳定表达的nuRNAs（hsa-let-7a，hsa-miR-24，hsa-miR-376b，hsa-miR-21，hsa-miR-221 and miR-34a）进行验证。实验分别以G1、S、G2/M期细胞的总RNA为模板，使用两步法荧光定量PCR方法，扩增目的基因，同时设立5S rRNA为内参。反应结束后，以5S rRNA为内参，采用2-△△CT方法来计算每种miRNA的相对定量值。各组间miRNA的表达变化以G1期该miRNA的表达值为对照，采用倍数改变的方式来描述S期和G2/M期该miRNA的相对表达值。结果发现，miR-221、miR-21、let-7a、miR-34a的表达具有细胞周期特异性，而miR-24和miR-376b的表达在细胞周期进程中波动较小。与G1期相比，S期和G2/M期miR-221和miR-21的相对表达值分别是3．60、4．25、2．48、3．42（芯片结果为3．82、5．23、2．63、3．95）；miR-34a和let-7a的相对表达值分别是0．93、2．71、0．54、2．70（芯片结果为0．64、3．71、0．79、2．33）； miR-376b和miR-24的相对表达值分别是1．08、1．10、0．85、1．24（1．04、1．58、0．48、0．61）。与芯片结果基本相符，验证了芯片结果的可靠性。