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第一部分重组人HIF-1α的真核表达载体质粒的构建和鉴定目的:构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒,为进行治疗性血管再生研究做准备。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果:获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论:重组的人HIF-1α,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,为利用其进行治疗性血管再生研究奠定了基础。第二部分重组人HIF-1α的真核表达载体质粒的功能表达目的:构建编码重组人HIF-1α真核表达载体质粒,研究体外培养的哺乳细胞中靶基因表达的有效性。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。用构建完成的重组HIF-1α质粒和空白病毒转染人胃癌SGC-7901细胞,并在不同时相收集转染的细胞进行RT-PCR和Western blot检测。结果:检测靶基因VEGF mRNA表达及其蛋白翻译的结果类似。转染细胞24—72小时之后,重组HIF-1α质粒各组VEGF mRNA的表达水平均明显高于对照各组,差异显著(P<0.001)。与空白对照组相比,重组rHIF-1α质粒组VEGF蛋白的表达在24小时组即有明显增加,但与48小时组相比差异无显著性(P>0.05)与72小时组相比差异显著(P<0.001)。72小时组的表达量最高,与其它各组比较差异均显著(P<0.001)。结论:成功构建了重组的人HIF-1α质粒载体之后,在体外转染哺乳细胞中可有效地表达靶基因VEGF mRNA并翻译成相应的蛋白,达到了实验的目的。为利用其进行治疗性血管再生研究奠定了基础。第三部分应用AdMax腺病毒载体系统构建人HIF-1α重组腺病毒目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组HIF-1α基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法:自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果:经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论:成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体,为进一步血管再生研究奠定了基础。第四部分腺病毒介导的重组人HIF-1α诱导大鼠后肢缺血模型的血管再生作用目的:观察成年大鼠和老年大鼠体内注射先期构建的腺病毒介导的重组人HIF-1α表达载体在缺血的骨骼肌组织对血管的再生作用并进行比较。方法:建立大鼠后肢缺血模型,成年(n=8)及老年(n=7)组均随机分成缺血对照组(A、C组)和缺血治疗组(B、D组)。建模24小时后,B、D两组右后肢缺血骨骼肌局部5处分别注射腺病毒rh-HIF-1α载体(每处1×108pfu/0.1m1),A、C两组在左后肢相应部位注入PBS液(每处0.1ml)。术后2周、4周麻醉大鼠后,切取四组大鼠后肢缺血骨骼肌组织进行HE染色和血管内皮细胞的免疫组化检查。结果:实验动物大体观察B、D组在同等干预下,术后四周后肢缺血状况有明显改善,与自身对照组及术后二周比较差异均显著。转染后第二周、四周毛细血管密度观察显示建模后各组的毛细血管密度均随时间延长而增加。D组与B组无差异,但两组均较对照组(A组和C组)有明显的增加。结论:腺病毒介导的rhHIF-1α基因在缺血的肌肉组织包括成年大鼠和老年大鼠治疗组均有微小血管大量生成,诱导了血管再生,但成年大鼠和老年大鼠两组间无差异。说明ad-rhHIF-1对老年大鼠的治疗性血管再生作用至少与成年大鼠的治疗效果是类似的。