研究背景宫颈癌是世界范围内发病率居第二位的女性恶性肿瘤,主要由高危人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持续感染导致。高危HPV感染上皮细胞后,病毒基因与宿主基因组整合,表达癌蛋白E6和E7,分别与肿瘤抑制基因P53和RB结合,干扰细胞周期调控,导致癌变。目前宫颈癌筛查的方法多采用宫颈脱落细胞学检查及HPV检测。细胞学检测是依赖主观的形态学检测,具有相对不敏感,重复性差,易出现判读结果争议的局限性。HPV检测客观、高通量、具备高度的敏感性和阴性预测值。但是普通人群中HPV感染率高,多数HPV阳性的病人在1-2年内就会转阴,大量HPV阳性而细胞学阴性的患者的分流处理成为亟待解决的问题。HPV在人群中的感染率较高,而宫颈癌发病率要低得多。因此在HPV感染与宫颈癌的发病之间,存在其他重要的基因事件。这些基因事件的发生率低于HPV的感染率,其对宫颈病变的诊断特异性也优于HPV检测。在临床实践中,CIN1可以在特定的时间间隔内随访,而CIN2+则给予外科干预。能有效区分低度病变和高度病变的标志物,其表达水平必须在低度病变和高度病变之间有明显的差别,即这一标志物的改变必须是发生在宫颈病变早期的事件。HPV的整合感染可以导致原癌基因的扩增和染色体不稳定,这些都是宫颈癌变的早期事件。比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)研究证实,宫颈细胞由非典型增生向宫颈癌转变的过程中最常见的扩增为3号和8号染色体长臂扩增。人类染色体端粒酶RNA基因(TERC基因,位于3q26.3)是宫颈癌中最常见的扩增基因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡,导致肿瘤产生。C-MYC基因定位于8q24,是高危HPV的最常见整合位点,该基因的扩增与表达增加也常见于宫颈癌。因此,TERC基因和C-MYC基因的异常扩增可能是宫颈癌形成的早期事件。原癌基因的扩增检测可以通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术实现。FISH技术操作相对简单,重复性好,信号判读客观,并具有较好的灵敏性及特异性,可以用于间期细胞,适于临床医学检测。FISH技术在临床上已经广泛应用。最常见的领域有产前诊断、血液病、实体瘤的检测等,并已经可以用作液基细胞学标本的原癌基因扩增检测。本课题通过检测剩余宫颈液基细胞学标本中TERC基因和C-MYC基因的扩增,以及高危HPV的感染情况,分析原癌基因扩增和病毒感染以及细胞学、组织学诊断之间的联系,分析TERC和C-MYC在不同组织学级别的扩增类型,分析TERC和C-MYC单用或者联合其他指标应用诊断宫颈癌前病变的特性,并探讨一种优化的、可供选择的宫颈癌筛查方案。第一部分宫颈液基细胞学标本中TERC和C-MYC扩增类型比较研究目的：1.探讨TERC和C-MYC不同诊断阈值在宫颈病变筛查中的作用。2.比较TERC和C-MYC在正常/低度病变和高度病变之间异常细胞比率和扩增类型的差异。3.比较TERC和C-MYC在宫颈病变筛查中的诊断特性。研究方法1.收集山东大学齐鲁医院2010年8月至2011年2月门诊病例243例,患者年龄25-64岁。其中包含无上皮内病变或恶性病变(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM)132例,未名意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS)50例,低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)21例,非典型鳞状上皮细胞,倾向高度病变(atypical squamous cells that cannot be excluded for high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)14例,高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)23例,鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC3例。2.应用FISH检测剩余宫颈液基细胞学标本中TERC和C-MYC基因的扩增,并记录异常核比例和扩增类型。3.所有病例经过阴道镜下活检及组织学评估。其中正常164例,宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)1级29例,CIN221例,CIN322例,SCC7例。结果1.在不同的TERC异常核比例中,TERC异常核比例≥5%具有最高的结合敏感性与特异性(AUC=0.9, DFI=0.2)。在不同的C-MYC异常核比例中,C-MYC异常核比例≥3%具有最高的结合敏感性与特异性(AUC=0.8,DFI-0.3)。在不同的TERC最大拷贝数(gene copy number,GCN)中,TERC GCN≥5具有最高的结合敏感性与特异性(AUC=0.8, DFI=0.3)。在不同的C-MYC GCN中,C-MYC GCN≥4具有最高的结合敏感性与特异性(AUC=0.7,DFI=0.4)。2.在NILM, ASCUS, LSIL, ASC-H, HSIL和SCC中,TERC基因的扩增阳性率分别为8.3%,20.0%,52.4%,64.3%,91.3%和100.0%。C-MYC基因的扩增阳性率分别为22.0%,26.0%,57.1%,42.9%,87.0%和100.0%。在正常,CIN1, CIN2, CIN3和SCC中,TERC基因的扩增阳性率分别为9.2%,17.2%,76.2%,100.0%和100.0%。C-MYC的扩增阳性率分别为20.7%,31.0%,71.4%,81.8%和100.0%。3. TERC和C-MYC的扩增阳性率在LSIL(或者更低)和HSIL(或者更高)之间存在显著差异(P<0.01)。TERC和C-MYC的扩增阳性率在正常/CIN1组和CIN2+组之间存在显著差异(P<0.01)。4.在正常／低度病变组和高度病变组,TERC日性病例的平均异常核比例存在显著差异(10.2%vs.21.1%,P<0.05)；C-MYC日性病例的平均异常核比例也存在显著差异(6.2%vs.20.9%,P<0.05)；TERC高水平扩增核比例存在显著差异(2.3%vs.16.8%,P<0.05)；C-MYC高水平扩增核比例不存在显著差异(1.7%vs.3.0%,P>0.05)5.与细胞学比较,TERC具有较高的敏感性(90.0%vs.84.0%)和特异性(89.6%vs.64.3%),C-MYC具有较低的敏感性(80.0%vs.84.0%)和较高的特异性(77.7%vs.64.3%)。TERC的敏感性和特异性均高于C-MYC(90.0%vs.80.0%,89.6%vs.77.7%)。与单独TERC检测比较,C-MYC和TERC联合检测(两项扩增视为阳性)的敏感性由90.0%下降为78.0%,特异性由89.6%上升到95.3%; C-MYC和TERC联合检测(一项扩增视为阳性)的敏感性由90.0%上升为92.0%,特异性由89.6%下降到72.0%。结论1. TERC和C-MYC勺不同异常核比例和扩增类型相比较,异常核比例较之GCN且有更高的结合敏感性及特异性。TERC扩增检测比C-MYC检测具有更高的结合敏感性与特异性。TERC异常核比例≥5%具有最高的结合敏感性与特异性。2. TERC和C-MYC的扩增阳性率在CIN2+组高于正常/CIN1组。3.在CIN2+组中,TERC高水平扩增核比例增加,扩增类型多样；对于C-MYC这种差别则不显著。4.与细胞学比较,TERC具有较高的敏感性和特异性,适合宫颈癌筛查。C-MYC敏感性低,不适合宫颈癌筛查。联合应用C-MYC和TERC检测只能略微增加TERC检测的敏感性,而显著降低特异性。第二部分TERC和液基细胞学、HPV检测联合应用于宫颈癌筛查研究目的：1.计算不同细胞学诊断和组织学诊断下TERC的扩增阳性率和HPV的感染率。2.比较TERC和HPV在正常/低度病变和高度病变之间阳性率的差异。3.比较TERC、液基细胞学和HPV检测在宫颈病变筛查中的诊断特性。4.分析TERC扩增阳性率和GCN与HPV病毒载量的关系。5.探讨最佳的TERC、液基细胞学和HPV联合检测宫颈癌的筛查方案。研究方法1.收集山东大学齐鲁医院2010年8月至2011年2月门诊病例671例,患者年龄25-64岁。其中NILM557例,ASCUS52例,LSIL21例,ASC-H14例,HSIL24例,SCC3例。2.应用FISH检测剩余宫颈液基细胞学标本中TERC基因的扩增,并记录异常核比例和扩增类型。3.应用HC2HPV DNA检测剩余宫颈细胞学标本中HPV感染。4.其中243例病例经过阴道镜下活检及组织学评估。结果1.在NILM,ASCUS, LSIL, ASC-H, HSIL和SCC中,TERC基因的扩增阳性率分别为2.7%,19.2%,52.4%,64.3%,91.7%和100.0%。HPV的阳性率分别为24.0%,50.0%,71.4%,71.4%,91.7%和100.0%。在正常,CINl, CIN2, CIN3和SCC中,TERC基因的扩增阳性率分别为9.2%,17.2%,76.2%,100.0%和100.0%。HPV的阳性率分别为51.2%,82.8%,100.0%,100.0%和100.0%。2. TERC扩增阳性率在LSIL(或者更低)租HSIL(或者更高)之间存在显著差异(P<0.01)。TERC的扩增阳性率在正常/CIN1组和CIN2+组之间存在显著差异(P<0.01)。3. TERC扩增检测的敏感性(90.0%)介于HPV检测(100.0%)和细胞学(84.0%)之间。TERC的特异性(89.6%)高于HPV检测(44.0%)和细胞学检测(64.3%)(P<0.05)。4. TERC扩增率在HPV阴性、低度阳性、中度阳性、高度阳性组分别为1.0%±1.4%、3.0%±9.5%、5.0%±8.8%、9.6%±16.2%,呈现依次增高趋势,在阴性与阳性组存在统计学差异(P<0.05)；在阴性与低度阳性组存在统计学差异(P<0.05)；在低度与中度阳性组、中度与高度阳性组中尚未有明显统计学差异(P>0.05)。TERC GCN在HPV阴性、低度阳性、中度阳性、高度阳性组分别为2.7±0.8、3.2±2.4、3.9±2.7、4.4±2.6。在阴性与阳性组存在统计学差异(P<0.05)；在阴性与低度阳性组存在统计学差异(P<0.05)；在低度与中度阳性组、中度与高度阳性组中尚未有明显统计学差异(P>0.05)。5.在细胞学、HPV检测和TERC扩增检测的组合筛查策略中,HPV和TERC联合检测(两项扩增为阳性)具有最高的结合敏感性与特异性(敏感性为90.0%,特异性为92.2%)。结论1. TERC的扩增阳性率和HPV的感染率随着细胞学和组织学诊断而增加,且在CIN2+组高于正常/CINl组。2.细胞学、HPV检测与TERC扩增检测比较,HPV检测具有最高的敏感性,但具有最低的特异性。TERC具有最高的特异性,和比细胞学高的敏感性。3. TERC扩增阳性率和GCN都与HPV的病毒载量存在相关性,但并非绝对一致性。4.联合应用HPV和TERC检测能弥补彼此的不足,发挥各自的优点,是一种有着较高的结合敏感性和特异性的筛查方案。