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猪圆环病毒病是近年新发现的一种猪的传染病,由猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine Circovirus, PCV2)引起一种多系统功能障碍性疾病。1991年加拿大首次报道该病后,世界上许多国家和地区相继报道了该病的发生和流行,它给世界养猪业造成了相当大的经济损失。PCV2不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的病原,而且能够引起多种猪病如猪皮炎及肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎、猪呼吸与繁殖障碍综合征等。钙结合蛋白是一种小分子蛋白家族。它与钙离子结合,能够调控多种重要的生理功能,如转录因子表达、细胞生长分化、酶活性、炎性应答等。钙结合蛋白是钙离子执行生理功能过程中关键成分。猪源钙结合蛋白S100A9和S100A12是相对分子量较小的蛋白,大小约为18.4kD和11.8kD。本实验室前期研究中,发现PCV2可以引起S100A9和S100A12这两个基因的表达上调。有研究报道发现人S100A8/S100A9复合体可以通过NF-κB途径放大由巨噬细胞产生的促炎性因子,S100A12与受体结合后激活NF-κB细胞内信号通路,诱导产生细胞因子和粘附分子调节促炎性作用,但是鼠S100A9却可以抑制NF-κB的激活,而NF-κB是激活产生炎性应答的重要转录因子,它的激活对于细胞抗病毒和抗感染有很重要的意义。本实验以猪S100A9和S100A12为研究对象,对它们是否也具有激活NF-κB功能,以及它们在PCV2增殖中的作用进行了初步探讨,结果如下：1.猪S100A9和S100A12基因的克隆和多克隆抗体制备克隆了猪S100A9和S100A12基因的CDS全长序列,并且构建原核表达质粒pGEX-KG-S100A9和pGEX-KG-S100A12,诱导蛋白表达,成功制备小鼠抗S100A9和S100A12的多克隆抗体血清。2.猪S100A9和S100A12真核转染以及亚细胞定位构建猪S100A9和S100A12基因的真核表达质粒PEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S100A12,将真核表达质粒转染到PK-15细胞中并成功表达,经激光共聚焦扫描显微镜观察亚细胞定位,发现S100A9主要存在于细胞浆中,而S100A12在细胞浆和细胞核中都有分布。3.猪S100A9和S100A12对PK-15细胞IKB以及IL-6、IL-8和IL-10表达的影响Western Blot检测转染真核表达质粒pEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S100A12的PK-15细胞,发现S100A9和S100A12都抑制IKB的表达,Real-Time PCR检测发现IL-6、IL-8和IL-10的表达也均被抑制,由于IKB和IL-6、IL-8和IL-10分别为NF-κB信号通路的上下游因子,表明S100A9和S100A12都可以抑制NF-kB激活,并且S100A12的抑制效果更明显。4.PCV2感染对PK-15细胞S100A9和S100A12表达的影响将PCV2与PK-15细胞同步接种,在PCV2的作用下,PK-15细胞中S100A9、S100A12的mRNA表达水平均显著升高(p≤0.05或p≤0.01)。随着时间的推移,它们的mRNA表达呈下降趋势,在48h时又再次显著上升。该实验表明PCV2会引起细胞中S100A9和S100A12的表达上升,并呈时间相关性。5.猪S100A9和S100A12对PCV2增殖的影响将将真核表达质粒pEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S100A12转染到PK-15细胞中,24h后在荧光显微镜下观察到目的基因表达后接种PCV2病毒。实验表明S100A9和S100A12都有助于PCV2在细胞内的复制,差异显著(p≤0.01)。但S100A9的促进作用随着时间而下降,在12、24、36h时PCV2的拷贝数分别是对照组的1.76、1.12、1.54倍,24、36h表现与对照组无差异；S100A12则显著促进PCV2在细胞内的复制,并且随着时间变化,这种促进作用持续稳定,在12、24、36h时PCV2的拷贝数分别是对照组的1.51、3.99、3.2倍,S100A12很有可能在PCV2感染和增殖的过程中起到很重要的作用。