背景：弓形虫是一种专性细胞内的寄生原虫，呈世界性分布，能引起人兽共患的弓形虫病。全世界约有1/3的成年人感染弓形虫。若孕妇感染弓形虫，则虫体可经胎盘传给婴儿，导致流产、畸胎；而在肿瘤患者、AIDS病人等免疫功能严重受损者，作为一个主要的机会致病因子，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一。因此，为了防治弓形虫病，迫切需要研制出一行之有效的弓形虫疫苗。已有研究表明，弓形虫的主要表面抗原P30具有很强的免疫原性，是非常理想的候选疫苗分子。与传统疫苗相比，90年代发展起来的核酸疫苗技术因其潜在的优势使其得到迅速而广泛的应用。目前，弓形虫核酸疫苗的研究也取得了一些进展，已经证实用编码弓形虫P30抗原的质粒DNA进行核酸免疫，能够引起特异性的抗感染免疫应答，但是，弓形虫P30基因不同表达形式的重组质粒所产生的免疫效果如何，尚不得而知。 目的：通过构建含弓形虫P30基因不同表达形式（膜型、分泌型及细胞内型）的重组质粒，并将其免疫小鼠，测定抗体水平，以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗分子。 方法：1、弓形虫表膜型P30基因重组质粒的构建：设计并合成了一对引物，利用PCR技术，从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出完整的P30编码序列（包括信号肽及疏水尾），将其克隆到真核表达载体pcDNA中，构成pcDNA3-P30Mb。 2、弓形虫分泌型P30基因重组质粒的构建：回收纯化PCR扩增的P30基因片段，用PstI切去C端的疏水氨基酸序列，再克隆到pcDNA中，构成pcDNA3-P30Se。 3、弓形虫细胞内型P30基因重组质粒的构建：用限制性内切酶EcoRI和BamHI将重组质粒pBV220-P30In的小片段切下，亚克隆到pcDNA中，目为pcDNA3-P30In。 4、将质粒DNA与lipofectin以5:2的比例混合，经小鼠股四头肌注射，5ug/只。2周后，加强注射一次。分别于免疫前及免疫后2周、4周、6周自小鼠尾静脉采血，用Westernblot和ELISA检测IgG抗体水 5、诱导含昨T－A SP30 A PI的工程菌表达 P30蛋白并纯化，免疫印D 迹测定其免疫活性，以用于检测小鼠血清中的特异性抗体。同时，对纯DD 化条件进行优化。Dl 结果：l、经双酶切鉴定及DNA序列测定，三种重组质粒中的插入 ll 片段确为弓形虫P30的编码基因且读码框架正确。l12、小鼠血清中IgG抗体的检测：免疫印迹显示，免疫后2周，除lD 细胞内型重组质粒免疫组外，膜型及分泌型兔疫组均出现较弱的反应D 带，且前者显色略浅，在免疫后4周和6周，三个兔疫组均显示IgG抗 体反应带，且各组之间颜色深浅无明显差异。另一方面，从IgG抗体产l 生的时间进程来看，免疫后2周，抗体反应带较弱，而在免疫后4周和l16周，抗体反应显著增强，同时也可看出，4周和6周的反应带深浅无l 明显变化。ELISA定量结果显示，空载体pCDNA3注射组与三种重组质D 粒注射组之间有显著性差异o功刀5），说明弓形虫P3O基因的重组质D 粒确实能够诱导机体产生特异性抗体；免疫后2周，pcDNA3I30In注 射组与PcDNA3P30Mb和PcDNA3I30Se注射组之间的差别具有显著。＠u＜0．05），thegM＃ZredIBARgH0＞0．05）；the＆＆s 4 N和～16周，三个免疫组之间的 IgG抗体水平无显著性差异0＞0．05）；同 l ＃，）A IgG ftWPI％rtfedsfg＄％，m＆ti 2 MghffiW7k4K（ff，f～l 了第4周和6周时，各免疫组的IgG抗体均较二周时明显增加，但4周ll 和 6周之间的 IgG抗体水平无明显变化0＞0．05），表现为一平台期。l13、纯化蛋白能与弓形虫病人阳性血清反应，出现了特异性反应lIw。l14、经免疫印迹显示，浓缩至初始体积的1／3刁历时，纯化蛋白的反”lD 应带颜色最深，说明此时有活性的纯化蛋白的浓度最高。D 结论：l、成功地构建了弓形虫P30基因三种表达形式的重组质D 粒。D12、用编码P30抗原的重组质粒进行核酸免疫，能够诱导免疫小鼠 l 产生特异性的IgG抗体。膜型及分泌型重组质粒诱导IgG抗体的出现先 于细胞内型。但随着时间延长，其抗体水平无明显差别。因此，就产生IIgG抗体而言，三种重组质粒的免疫效果是基本相同的。l 3、本方法表达纯化的P30蛋白具有免疫学活性，可用于体外检 测。在纯化过程中，最佳浓缩程度是浓缩至初始体积的1／3－l／6，此时，D 有活性的纯化蛋白浓度最高。